酿酒酵母菌诱导SBD-1mRNA表达的研究

金 鑫 ， 张 曼 ， 田巧珍 ， 刘 骄 ， 王云鹤 ， 杨银凤

(内蒙古农业大学兽医学院 ，内蒙古呼和浩特010018 )

酿酒酵母菌诱导SBD-1mRNA表达的研究

金 鑫 ， 张 曼 ， 田巧珍 ， 刘 骄 ， 王云鹤 ， 杨银凤

(内蒙古农业大学兽医学院 ，内蒙古呼和浩特010018 )

为了探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(Sheep Beta-Defensin-1, SBD-1)表达的调节作用。建立绵羊瘤胃上皮细胞培养体系作为体外试验模型，用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养，然后利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)研究接受刺激后瘤胃上皮细胞中SBD-1 mRNA表达的差异。结果表明，在各时间组内，SBD-1 mRNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势，当菌液浓度为5.2 × 107CFU/mL时表达量均达到最大，并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P﹤0.01)。当菌液浓度一定时，SBD-1 mRNA的表达量先是随着诱导培养时间的延长而呈上升趋势，诱导培养时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到峰值，之后呈下降趋势。因此，当浓度为5.2 × 107CFU/mL的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时，SBD-1基因的表达量达到最高，且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P﹤0.01)。本试验结果表明，酿酒酵母菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达，且浓度为5.2 × 107CFU/mL的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时，SBD-1的表达量达到最高。

β-防御素-1 ； 瘤胃上皮细胞 ； 酿酒酵母菌 ； 实时荧光定量PCR ； 绵羊

防御素是一种存在于生物界中具有广谱抗微生物活性的阳离子内源性抗菌肽[1]。β-防御素作为防御素家族中的一大成员，广泛存在于哺乳动物和禽类体内[2-3]，主要由各器官上皮细胞产生[4]。在绵羊体内发现有两种β-防御素存在，即 SBD-1、SBD-2[5]，通过RT-PCR检测显示，SBD-2 mRNA只表达于舌和远端回肠，而SBD-1 mRNA在气管和整个消化道都有表达，并且在瘤胃中表达量较多[6-7]。由此提示，β-防御素是绵羊瘤胃天然免疫的重要组成部分。

益生菌作为一种重要的绿色饲料添加剂，已广泛用于畜禽饲料中以提高动物健康和生产性能[8]。农业部2013年修订的《饲料添加剂品种目录》中新增加了4个品种，其中3个与益生性酿酒酵母菌有关(酿酒酵母培养物、酿酒酵母提取物、酿酒酵母细胞壁)[9]，益生菌粘附并定植于肠道上皮细胞是其发挥益生作用的前提，上皮细胞是益生菌发挥益生作用的重要扮演者[10]。而酿酒酵母菌与瘤胃上皮细胞相互作用过程中抗菌肽的表达变化尚未见相关报道，因此本试验采用RT-qPCR技术检测酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1 mRNA表达的影响。为从益生菌与上皮细胞抗菌肽表达关系的新角度解析防御素发挥非特异性免疫的新途径和机制提供一定的基础及依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验动物来自呼和浩特市北亚屠宰场健康状况良好的绵羊，试验所用酿酒酵母菌菌株，购自中国微生物菌种网(编号：CGMCC2.161)。

1.2 试验方法

1.2.1 绵羊瘤胃上皮细胞的原代培养及传代培养 试验在借鉴前人[11-13]培养RECs经验的基础上，对绵羊RECs的培养方法进行了改进。将瘤胃组织用0.25% 胰酶在37 ℃温箱中进行不同时间的连续消化，并将所得细胞于37 ℃、5% CO2的培养箱中静置培养。大约96 h后，培养的上皮细胞已贴壁，此时更换新的完全培养基，之后每两天换液1次。当原代细胞数量长到细胞培养瓶的80%～90%以上时，便可将细胞进行传代培养，传于12孔板用于后续的细胞诱导试验。

1.2.2 酿酒酵母菌对瘤胃上皮细胞的诱导试验 将传代细胞用无血清无抗生素的DMEM/F12培养基进行24 h饥饿处理后，用无双抗的PBS洗涤3次，然后向细胞板中每孔加入900 μL 的无血清无抗生素的DMEM/F12培养基，并分别加入100 μL浓度为5.2×108、5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU/mL的酿酒酵母菌液作为试验组和DMEM/F12培养基作为空白对照组，置37 ℃温箱刺激2 h。分别刺激2 h后，吸去培养基，用含两性霉素B的PBS洗涤3次，重新加入含两性霉素B、无血清的DMEM/F12培养基以杀死残存的活菌，继续诱导培养2、4、8、12、24 h后分别提取各组总RNA。

1.2.3 RT-qPCR 根据GenBank公布的SBD-1基因和管家基因β-Actin序列用DNAStar软件设计引物，引物序列见表1，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 实时荧光定量 PCR 引物序列

以cDNA为模板，进行RT-qPCR反应。每个样品的SBD-1基因和β-Actin基因分别做5个重复。反应结束后，根据扩增曲线的Ct值计算SBD-1基因的相对表达量。

1.2.4 SBD-1 mRNA表达水平的计算 试验在同一批次细胞内重复5次，将RT-qPCR得到的SBD-1基因和β-Actin基因的Ct值，根据公式2-ΔCt[14]求出添加不同浓度酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的相对表达量，其中ΔCt=Ct(SBD-1)-Ct(β-Actin)，并进行统计分析。

2 结果

2.1 细胞培养结果 传代细胞生长迅速，4 d后细胞即有90%以上聚集生长，长成漩涡状排列的致密单层细胞集落，同时细胞界限较为清晰，胞浆呈颗粒状，核圆而大(如图1)。

图1 绵羊瘤胃上皮细胞培养结果

2.2 酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1 mRNA相对表达量的影响 数据处理后经SAS9.2软件分析，结果如图2所示，当用不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞 2 h后继续诱导培养2、4、8、12、24 h，在各诱导培养时间组内随着菌液刺激浓度的增加SBD-1 mRNA的表达量均呈先升高后降低的趋势，当菌液刺激浓度为5.2×107CFU/mL时表达量达到最大，并与对照组和其他浓度组相比差异均极显著(P<0.01)。当刺激菌液浓度为5.2×104CFU/mL、诱导培养瘤胃上皮细胞4 h时SBD-1 mRNA表达量达到最大，极显著高于诱导培养2、24 h组(P<0.01)，但与诱导培养8、12 h组相比差异不显著(P>0.05)。当菌液刺激浓度为5.2×105、5.2×106、5.2×107、5.2×108CFU/mL时，SBD-1 mRNA的表达量随着诱导培养时间的延长而呈上升趋势，诱导培养时间为12 h时SBD-1 mRNA表达量达到最大，之后呈下降趋势。因此，当刺激浓度为5.2×107CFU/mL的菌液诱导培养瘤胃上皮细胞12 h时，SBD-1基因的表达量达到最高，且与此浓度下其他诱导培养时间组的表达量相比差异均极显著(P<0.01)。

图2 酿酒酵母菌对瘤胃上皮细胞SBD-1 mRNA表达的时间和浓度依赖关系**：P < 0.01，与空白组比较

3 讨论

为了揭示益生菌浓度、刺激时间、防御素表达量三者之间的关系，本试验从mRNA水平对SBD-1基因进行检测，结果发现，酿酒酵母菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达作用存在剂量—时间依赖关系，但浓度过低或过高都会使SBD-1 基因表达效果降低，当菌液浓度为5.2×107CFU/mL诱导瘤胃上皮细胞12 h时SBD-1基因的表达量达到最高。2008年Schlee等[15]研究发现，不同的益生乳酸菌株与人β-防御素-2(HBD-2)的表达量存在剂量—时间依赖关系，HBD-2 mRNA表达量随着不同益生菌液剂量增大而增加，且刺激6 h后达到峰值。2012年黎观红等[16]发现用菌液浓度为2×106CFU/mL的鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞刺激12 h，表达量达到峰值。本试验结果与以上两人的研究结果基本相同，但当抗菌肽达到最高表达量时所用的菌液浓度和刺激时间却存在差异，这可能是由于试验动物种属间存在差异和不同菌体具有不同的有效刺激成分有关。

综合本试验结果可以推断，益生性酿酒酵母菌促进或诱导绵羊瘤胃内SBD-1基因的表达可能是其发挥益生作用尤其是免疫促进作用的一种重要作用方式。酿酒酵母菌通过上调绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1基因的表达而提高瘤胃天然免疫功能。因此，益生性酿酒酵母菌可能通过诱导或促进瘤胃抗菌肽的表达在黏膜局部形成高浓度，从而抑制和杀灭瘤胃内有害菌并调节有益菌数量和种类以维持瘤胃微生态平衡。同时，瘤胃上皮细胞分泌的抗菌肽可作为细胞间的信号分子发挥多重免疫调节作用。

4 结论

本试验结果在印证益生菌能够诱导人和哺乳动物胃肠道上皮细胞抗菌肽表达的同时，进一步从mRNA水平得出了酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1基因的表达，且浓度为5.2×107CFU/mL的菌液诱导瘤胃上皮细胞12 h时SBD-1基因的表达量达到最高。

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Study on the expression of SBD-1 mRNA induced by Saccharomyces cerevisiae

JIN Xin , ZHANG Man , TIAN Qiao-zhen , LIU Jiao , WANG Yun-he , YANG Yin-feng

(College of veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

In this study，we investigated the effect of probioticSaccharomycescerevisiaeon the β-defensin-1 (Sheep Beta-Defensin-1, SBD-1) expression in cultured ruminal epithelial cells of sheep. The ruminal epithelium cells(RECs) of sheep were cultured successfully in vitro, and the RECs were stimulated 2 h with different concentrations ofSaccharomycescerevisiae, and then for different times. Then the expression of SBD-1 mRNA was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR). The results showed that the expression of SBD-1 mRNA in each time group were increased and then decreased following the increase of Saccharomyces cerevisiae concentrations.The expression of SBD-1 mRNA was highest and significantly higher than the control group and the other concentration groups (P< 0.01). When the cells were stimulated with the concentration of 5.2 × 107CFU·mL-1. When the concentration was constant, the expression of SBD-1 mRNA was increased with the extension of stimulating time, and the expression of SBD-1 mRNA was the highest at 12 h. Therefore, the expression of SBD-1 was the highest when the concentration of Saccharomyces cerevisiae was at 5.2 × 107CFU·mL-1and the stimulating was 12 h stimulating, compared with the other time groups at this concentration (P< 0.01). These findings indicate thatSaccharomycescerevisiaecan induce the expression of SBD-1 in ruminal epithelial cells of sheep. And the level of SBD-1 expression is highest when the rumen epithelial cells are stimulated with the concentration of 5.2×107CFU·mL-1for 12 h.

β-defensin-1 ; ruminal epithelial cells ;Saccharomycescerevisiae; realtime fluorescence quantitative PCR ; sheep

YANG Yin-feng

2016-09-29

金鑫(1990-)，男，博士，从事动物解剖及黏膜免疫工作，E-mail：jinxinnndsyxy@163.com

杨银凤，E-mail：julie1963@163.com

S826

A

0529-6005(2017)07-0010-03