竹鼠源致病性雷氏普罗威登斯菌的分离鉴定

唐海波 ， 陈凤莲 ， 饶桂波 ， 姜佳佳 ， 孟 菲 ， 白安斌 ， 杨 磊 ， 吴健敏

(广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 ， 广西南宁530001)

竹鼠源致病性雷氏普罗威登斯菌的分离鉴定

唐海波 ， 陈凤莲 ， 饶桂波 ， 姜佳佳 ， 孟 菲 ， 白安斌 ， 杨 磊 ， 吴健敏

(广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 ， 广西南宁530001)

为确定南宁隆安县某竹鼠养殖场发生竹鼠死亡的原因，从发病的竹鼠肝、肺及肾脏中分离得到2株可疑细菌, 经形态观察及16S rRNA 序列分析，鉴定两株细菌均为雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)。经小鼠回归试验证实该分离菌可致死小鼠。测序结果显示，该菌16S rRNA与雷氏普罗威登斯菌(AB680422)同源性高达99.9%。药敏试验显示，对头孢吡肟、头孢唑林、头孢氨苄等药物高度敏感；对青霉素、氯霉素、氟苯尼考、复方新诺明等药物有抗性。这些研究结果表明，雷氏普罗威登斯菌是隆安县某竹鼠养殖场竹鼠致死的病原菌。本文在国内外首次报道了雷氏普罗威登斯菌对竹鼠有较强的致病性。

竹鼠 ； 雷氏普罗威登斯菌 ； 分离鉴定

竹鼠，亦称竹狸、竹根鼠、茅根鼠等，在人工养殖类动物中，竹鼠是最耐粗食的经济类动物之一。其体大肉多，营养丰富，味道鲜美，具有较高的经济价值。竹鼠在中国已被大规模养殖，成为具有经济效益的养殖产业之一。广西是我国竹鼠养殖量最大的省份，广西桂林、南宁、柳州、河池等地均已建立有竹鼠养殖基地(场)。在国内，竹鼠已进入西南地区大中城市和城镇的消费市场，据不完全统计，广西、广东、香港、海南、福建、四川、湖南、上海等地每年消费竹鼠600多万只，且需求量以每年3%的速度递增，全国竹鼠的生产量远远不能满足市场急剧增长的需要。

作为一项仅发展10多年的新型养殖产业，竹鼠规模化养殖起步较晚，驯化时间不长，无论在饲养、繁殖还是疫病防控方面均存在许多亟待研究的问题，特别是在进行规模养殖后，随着养殖方式的改变，竹鼠生活习性、机体性能等方面也随之发生变化，从而引发出许多疾病。随着竹鼠产业的不断发展，对其疫病病原及防控技术开展系统性研究已迫在眉睫。已知竹鼠的病原包括细菌、病毒、真菌及寄生虫。其中，细菌疾病最为常见，已报道的有大肠杆菌、巴氏杆菌、肺炎克雷伯菌、链球菌等[1-4]。但是没有关于雷氏普罗威登斯菌引起竹鼠发病的报道。

1 材料与方法

1.1 采样及病理观察 2015年3月，广西南宁隆安县某竹鼠养殖场发生竹鼠死亡，病鼠被毛粗乱，消瘦，肛门粪便粘着。剖检症状：肠道出血并伴有大量胶胨样渗出物；肺出血、间质增宽；肝脏色浅、偏黄；肾脏肿大、出血。肉眼观察大体病理损伤后，取心、肝、脾、肺、肾及小肠，用中性福尔马林[5]进行固定后，送洛阳中科基因检测诊断中心进行切片与组织病理学观察。

1.2 主要试剂和实验动物 5%山羊鲜血营养琼脂培养基、常规试剂为实验室自制；胶回收试剂盒、PCRmix，购自北京康为世纪公司；DS 2000 DNA Marker，购自广州东盛生物科技有限公司；药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司; 4周龄的昆明系小鼠，购自广西医科大学。

1.3 细菌分离纯化 分别采集病死竹鼠的心、肝、肺、肾及肠道渗出物，接种5%鲜血琼脂平板，37 ℃培养16～24 h，挑选形态特征一致的单个菌落反复划线纯化培养，观察菌落颜色、形态特征，并分别挑取单个菌落进行革兰染色、镜检。根据菌落、菌体形态、染色特性进行初步判定，然后将典型菌落接种于营养琼脂，进行纯化培养备用。

1.4 16S rRNA基因序列测定及分析 取分离纯化菌按细菌基因组抽提试剂盒说明书提取DNA，以提取的DNA模板，利用16S rRNA 基因扩增引物(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′/5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′)[6]进行PCR扩增；PCR反应条件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，33个循环；72 ℃ 7 min；回收PCR 产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，利用BLAST 进行同源性比对，采用MEGA 5.0 的Neighbor-Joing(NJ)[7]法构建系统进化树。

1.5 药物敏感性检测 采用Kirby-Bauer 琼脂扩散法测量抑菌圈直径(IZD)，进行3个重复，取平均值。依据CLSI 的抗菌药物敏感性试验标准，判定分离菌株对药物的敏感性。

1.6 分离菌对小鼠的致病性试验 取体重18～22 g健康昆明系小鼠，分为试验组和对照组，每组各5只，试验组按照7.1×107CFU/mL浓度，每只小鼠腹腔接种菌液0.2 mL，对照组腹腔接种等量灭菌肉汤培养基，隔离饲养。注射后连续观察记录小鼠发病死亡情况，剖检发病死亡小鼠，并从内脏器官中分离细菌。

2 结果

2.1 竹鼠发病情况及剖检病变 该养殖场位于广西南宁隆安县南圩镇，远离村屯，已有3年养殖时间，共存栏800多只。半个多月前开始发病，幼鼠、成年鼠均有死亡，主要症状是精神沉郁，食欲下降，体况偏瘦，肛门粪便粘着，陆续死亡，累计死亡共22只。部分组织器官病变如中插彩版图1所示，两侧肺叶有出血点、出血斑，肺间质增宽；肠道出血并伴有大量胶胨样渗出物；肝脏颜色变浅、变黄，肾脏肿大、出血。

2.2 发病竹鼠病理组织学变化 上述病变组织器官经切片后进行组织病理学观察。H.E.染色结果如中插彩版图2所示，肺泡内有大量红细胞聚集，肺间质增宽，有炎性细胞侵润；肠黏膜脱落，杯状细胞增多，内有部分浆液性渗出物；肝内有大量脂肪泡，并有炎性细胞，部分血管有白细胞聚集，形成血管套；肾小球肿胀，肾小管出血，内有大量红细胞。

2.3 细菌分离培养结果 从发病竹鼠的肝、肺、肾分离到两株革兰阴性菌，挑取典型的菌落进行纯化培养观察，可见分离菌株在TSA平板上形成表面光滑、边缘整齐、圆形隆起的白色菌落。革兰染色为两端钝圆，无芽孢，无荚膜，多数单个存在的革兰阴性杆菌。

2.4 分离菌16S rRNA基因的扩增及序列分析 分离菌株PCR产物测序和序列分析发现，所获得的DNA片段为1 200 bp左右，同源性比对显示，两株分离菌16S rRNA基因100%同源，与雷氏普罗威登斯菌 NR_042413、AB680422等菌株16S rRNA基因存在99.6%～99.9%的同源性。进一步将其与GenBank 中登录的雷氏普罗威登斯菌菌株的16S rRNA 序列进行比对分析，构建系统发育树(图3)，进化树显示，该分离菌与AB680422株遗传关系最近，处于同一小分支上。结合分离菌株的形态特征，确定分离株为雷氏普罗威登斯菌，并将其命名为15-11-3/7。

图3 分离菌16S rRNA 基因进化树

2.5 分离菌药敏特性试验结果 对分离菌株进行药敏检测，结果见表1。分离菌对头孢吡肟、头孢唑林、头孢氨苄、亚胺培南等4种药物高度敏感；对多黏菌素，链霉素，恩诺沙星，庆大霉素，氧氟沙星，万古霉素，阿奇霉素，环丙沙星，林可霉素等9种药物中度敏感；对青霉素、氯霉素、氟苯尼考、复方新诺明、磺胺异恶唑等5种药物有抗性。

表1 雷氏普罗威登斯菌15-11-3/7药敏试验结果

2.6 致病性试验结果 小鼠腹腔接种攻毒试验结果显示，试验组小鼠在攻毒4 h后出现精神沉郁，呼吸急促，攻毒24～36 h后全部死亡，对照组小鼠均健活。剖检死亡小鼠，发现肝脏变色、肾脏肿大、肠系膜淋巴结出血。将从死亡小鼠内脏器官中分离到的细菌进行革兰染色，镜检显示分离菌与接种菌是一致的细菌。

3 讨论

本试验从患病的竹鼠内脏分离到两株细菌。基于分离菌的形态学观察及16S rRNA序列分析，确定两株致病菌均为雷氏普罗威登斯菌。该菌16S-rRNA基因序列与雷氏普罗威登斯菌(AB680422)同源性高达99.9%，且遗传关系最近，处于同一小分支上。这是国内外首次从竹鼠体内分离到雷氏普罗威登斯菌。

雷氏普罗威登菌属肠杆菌科、普罗威登斯菌属，是人兽共患的条件性致病菌，广泛分布于土壤、水体、下水道等自然环境以及苍蝇、鸟、猫、狗、牛、羊等的体表或肠道[8]。2006年卫生部把它列入人间传染的病原微生物名录。在人体主要可致人泌尿系统及肠道外感染，并引起感染医院的暴发流行。已报道引起人和动物尿路感染、伤口感染、眼结膜炎、腹泻、肺炎等多种病症[9-11]。食物在加工、运输、销售过程中很容易受该菌污染，引起食物中毒事件[12]。该菌也是一种动物的条件致病菌，战文斌等[13]首次从国内发病对虾中分离出该菌，王建昌等[15]报道了从进口美国种猪新鲜粪便样品中分离到雷氏普罗威登斯菌，秦毅斌等[16]从腹泻的仔猪内脏器官中分离到了该菌。雷氏普罗威登斯菌的致病机理比较复杂，对竹鼠所造成的疾病和症状，未曾报道。本试验分离得到的雷氏普罗威登斯菌，经接种小鼠显示了很强的致病性，这对竹鼠相关疾病的防治具有重要意义。

[1] 曾元根，邓治邦. 中华竹鼠大肠杆菌病诊断与防制[J]. 动物医学进展, 2002, 23(3)：94-95.

[2] 刘欢，苏丹萍，陈敏鸿，等. 竹鼠巴氏杆菌病的诊治[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(10)：165-167.

[3] 马磊，颜其贵，万莉，等. 竹鼠肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J]. 中国人兽共患病学报, 2011 , 27 (9): 825-827.

[4] 祝宇，时永强，王奇惠，等. 竹鼠沙门氏菌与链球菌混合感染的诊断[J]. 中兽医学杂志，2016, 4: 49-51.

[5] 张宝元. 10%福尔马林与中性福尔马林的比较[J]. 四川解剖学杂志，2001, 9(2)：97.

[6] 谢彬，袁洁，袁书智，等. 猪源绿色气球菌的分离鉴定与药敏特性研究[J]. 中国微生态学杂志，2010,25(3): 238-243.

[7] Tamura K, Peterson D, Peterson N,etal. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2 731-2 739.

[8] Ramkumar R, Ravi M, Jayaseelan C,etal. Description of Providencia vermicola isolated from diseased Indian major carp, Labeo rohita (Hamilton, 1822)[J]. Aquaculture, 2014, 420-421；193-197.

[9] Jim Manos, Robert Belas. The Genera Proteus, Providencia, and Morganella[J]. The Prokaryotes, 2006, 6: 245-269.

[10] Wang X, Wang J, Hao H,etal. Pathogenic Providencia alcalifaciens strain that causes fatal hemorrhagic pneumonia in piglets[J]. Curr Microbiol, 2014, 68 (3):278-284.

[11] Koreishi A F, Schechter B A, Karp C L. Ocular infections caused by Providencia rettgeri[J]. Ophthalmology, 2006, 113(8):1 463-1 466.

[12] Murata T, Iida T, Shiomi Y,etal. A large outbreak of foodborne infection attributed to Providencia alcalifaciens[J]. J Infect Dis, 2001, 184(8):1 050-1 055.

[13] 战文斌，周丽，陈章群，等. 一种新的对虾病原菌——雷氏普罗威登斯菌[J]. 中国水产科学，1997,4(1): 38-44.

[14] 王建昌，姜彦芬，王金凤，等. 猪源性bla_(NDM-1)阴性雷氏普罗威登斯菌的分离鉴定[J]. 中国动物检疫, 2015,32(4): 22-25.

[15] 秦毅斌，何颖，卢冰霞，等. 仔猪雷极氏普罗菲登斯菌的分离鉴定及系统进化分析[J]. 动物医学进展, 2015, 36(3): 35-40.

Isolation and identification of Providencia rettgeri from the diseased Bamboo rats

TANG Hai-bo , CHEN Feng-lian , RAO Gui-bo , JIANG Jia-jia , MENG Fei , BAI AN-bin , YANG Lei , WU Jian-min

(Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China)

To determine the pathogenic bacteria infecting the bamboo rats in the Longan of Nanning, two strains were isolated from the lung, liver and kidney of diseased bamboo rats. Identification by the morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis, demonstrated that the pathogenic bacteria were Providencia rettgeri. The pathogenic test showed that the isolate was highly pathogenic to the adult mice. Their 16S rRNA was closely related to Providencia rettgeri (AB680422) with a homology of 99.9%. The susceptibility test to antibiotis demonstrated that the Providencia rettgeri was highly sensitive to cefepime, cefazolin, cephalexin, etc., and resistant to penicillin, chloramphenicol, florfenicol, compound sulfamethoxazole, etc. These findings suggest that Providencia rettgeri is the pathogen of the dead bamboo rats in Longan of Nanning. This is the first report, showing that Providencia rettgeri has strong pathogenicity to bamboo rats at home and abroad.

Bamboo rat ; Providencia rettgeri ; Isolation and identification

WU Jian-min

2016-10-25

广西水产畜牧局科技推广应用项目(桂渔牧科201452004); 广西基本科研业务费专项(桂科专项15-4)

唐海波(1983-)，男，助理研究员，博士，主要从事动物传染病防治与分子病毒学研究，E-mail：thb514@163.com

陈凤莲(1972-)，女，研究员，硕士，主要从事分子病毒学和动物传染病研究，E-mail：c11212003@sina.com

吴健敏，E-mail：wu-jm20@163.com

S864.7

A

0529-6005(2017)07-0035-03

注：陈凤莲与唐海波对本文具有同等贡献