反复冻融对血清样品中三型口蹄疫免疫抗体效价的影响

赵明娟

(北京市怀柔区动物疫病预防控制中心 ， 北京怀柔101400)

反复冻融对血清样品中三型口蹄疫免疫抗体效价的影响

赵明娟

(北京市怀柔区动物疫病预防控制中心 ， 北京怀柔101400)

为了研究反复冻融对血清样品中免疫抗体效价的影响，随机采集50份采用口蹄疫O型、A型、亚洲1型三价灭活疫苗进行过多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清样品，采用液相阻断酶联免疫吸附试验分别检测其中口蹄疫O型、A型、亚洲1型免疫抗体的效价。每份样品检测4次，检测时间分别为采样后、反复冻融1次后、反复冻融2次后、反复冻融3次后。冷冻条件为-20℃冷冻24 h，融解温度为25 ℃。统计分析样品4次检测的口蹄疫O型、A型、亚洲1型免疫抗体效价变化，采用单因素方差分析进行差异显著性分析。结果显示，采样后、反复冻融1次、反复冻融2次、反复冻融3次所测得的口蹄疫O型、A型、亚洲1型免疫抗体效价差异均不显著，表明反复冻融3次以内不会影响血清样品中免疫抗体效价。

反复冻融 ； 血清样品 ； 免疫抗体效价

畜禽免疫抗体监测是畜禽重大动物疫病防控工作的重要环节，通过免疫抗体监测，不仅可以直接有效地反映畜禽体内免疫抗体水平，评估疫苗免疫质量和效价，制定科学的免疫程序[1]，同时也为动物疫病风险评估提供可靠依据，根据监测结果及时对不合格场户进行补免，预防群体发病，降低疫情发生风险，保障养殖户经济效益[2]。

作为实验室检验人员，正确地保存和处理送检样品、严格地试验操作都是确保试验结果准确性的必要条件[3]。根据《2015年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》，每种送检动物血清样品的抗体检测项目也包括3种以上，例如猪血清样品需检测的免疫抗体项目包括猪瘟、高致病性猪蓝耳病、口蹄疫O型等，奶牛血清样品需检测口蹄疫O型、亚洲1型、A型等，鸡血清样品需检测高致病性禽流感H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、新城疫等。在基层实验室，由于人力和设备的不足，很难一次完成所有项目的检测工作，待检血清样品反复冻融在所难免。

本试验通过研究反复冻融3次的奶牛血清样品中口蹄疫O型、亚洲1型、A型免疫抗体效价的变化，进一步揭示反复冻融血清样品对其中抗体效价会产生何种影响，以期为广大实验室工作人员合理安排免疫抗体检测试验提供参考，确保试验结果的准确性及有效性。

1 试验材料与方法

1.1 试验样品随机采集50份采用口蹄疫O型、A型、亚洲1型三价灭活疫苗进行过多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清样品，所使用的口蹄疫三价灭活疫苗由金宇宝灵生物药品有限公司生产。

1.2 试验设计，试验样品采集后，未经冷冻，第1次检测其中三型口蹄疫的免疫抗体效价，记录结果；血清样品经-20 ℃ 第1次冷冻24 h后，于25 ℃充分融解，第2次检测其中三型口蹄疫的免疫抗体效价，记录结果；血清样品经-20 ℃第 2次冷冻24 h后，于25 ℃充分融解，第3次检测其中三型口蹄疫的免疫抗体效价，记录结果；血清样品经-20 ℃ 第3次冷冻24 h后，于25 ℃充分融解，第4次检测其中三型口蹄疫的免疫抗体效价，记录结果。

1.3 试验试剂口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号20151027103-1，抗原批号15081003，抗原使用浓度1∶6；口蹄疫亚洲1型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号20150901102-1，抗原批号14122402，抗原使用浓度1∶6；口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒，中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号20151016101-7，抗原批号15080401，抗原使用浓度1∶15。

1.4 试验仪器与设备30～300 μL 12道移液器，5～50 μL 12道移液器，5～50 μL 单道移液器，1～10 mL 单道移液器，生产厂家均为Thermo。电热恒温培养箱，生产厂家Boxun，型号BPX-162。纯水仪，生产厂家HITECH，型号Master-S。自动洗板机，生产厂家BioTek，型号405LSRS。酶标仪，生产厂家Thermo，型号MULTISKAN MK3。

1.5 试验方法，血清样品三型口蹄疫免疫抗体检测均采用液相阻断ELISA方法开展，试验严格按照GB/T18935-2003口蹄疫诊断技术和试剂盒说明书进行操作。

1.6 试验结果统计分析，对4组试验数据采用单因素方差分析的方法进行统计学分析，研究其差异显著性。

2 试验结果，见表1。

表1 三型口蹄疫免疫抗体监测结果及分析统计

2.1 三型口蹄疫免疫抗体检测结果分析 通过观察与实验原始数据，每份样品4次检测的三型口蹄疫免疫抗体效价基本一致，偶尔有个别效价出现偏差，并未呈现规律性下降，分析原因可能是由于试验误差所致。

50份样品4次检测的三型口蹄疫免疫抗体效价平均值变化不大，相差在一个滴度内。

2.2 三型口蹄疫免疫抗体检测结果差异显著性分析 采用单因素方差分析对实验数据进行统计学分析，结果显示，三型口蹄疫免疫抗体检测结果P值均大于0.05，差异不显著，表明反复冻融3次以内不会造成待检血清样品中的三型口蹄疫免疫抗体效价产生变化。

3 讨论

3.1 钟锦辉(2013)通过实验证明，多次冻融不会造成血清猪瘟抗体效价的显著降低[4]。本试验结果表明，反复冻融3次以内不会对血清样品中的口蹄疫O型、亚洲1型、A型免疫抗体效价造成影响。在实验室人员和设备不足的情况下，将送检样品适当冻融不会造成检测结果的偏差，仍然具有可信度。值得注意的是，融解血清样品的温度不宜太高，本试验选择的是25 ℃，属于一般试验反应的正常温度，若融解温度高于37 ℃，可能引起样品变质，造成抗体效价降低。

3.2 疫苗免疫属于人工主动免疫，在畜禽体内产生的抗体主要成分为免疫球蛋白IgG。IgG在动物体内含量高、持续时间长，具有抗菌、中和病毒和毒素等免疫学活性，是畜禽机体内抗感染免疫的主力，也是血清学诊断和疫苗免疫后监测的主要抗体。由于免疫球蛋白属于大分子蛋白质，引起待检血清中免疫抗体效价降低的原因，可能是抗体在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，导致理化性质改变和生物学活性的丧失，即蛋白质发生变质。引起蛋白质变性的原因包括物理因素和化学因素两类。物理因素有加热、振荡、紫外线照射、超声波作用等；化学因素有强酸、强碱、重金属盐等。冷冻属于低温因素，并不是引起蛋白质变性的主要因素。有研究显示，血清样品，在2 ℃～8 ℃的冰箱中，可保存15 d，-15 ℃以下冷冻可保存2年[5]，因此，少次的反复冻融并不会对待检血清样品中的免疫抗体效价产生影响。

3.3 根据北京市动物疫病预防控制中心发布的《关于做好2016年动物防疫工作的通知》(京疫控〔2016〕16号)2016年北京市强制免疫动物疫病种类有7种，包括高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性猪蓝耳病、猪瘟、狂犬病、小反刍兽疫和羊布鲁菌病；根据《2016年北京市动物疫病监测计划实施方案》(京疫控〔2016〕15号)2016年动物疫病监测种类包括免疫抗体检测和病原学监测两大类。根据文件要求，每份待检血清样品检测项目都在5项左右，不需要反复冻融多次。本试验从实际出发，本着应用性强的原则，只研究了反复冻融3次以内血清样品中口蹄疫O型、亚洲1型、A型免疫抗体效价的变化情况，结果显示不受影响，但并不表明多次反复冻融不会导致血清样品中抗体效价降低，具体影响如何还有待进一步研究。

3.4 本试验只研究了反复冻融3次以内对待检血清样品中口蹄疫O型、亚洲1型、A型免疫抗体效价不会产生影响，在工作实践中，一份待检血清样品需要检测多种抗体效价的情况还包括猪、羊、犬、鸡、鸭、鹅等畜禽的血清样品。由于抗体的成分都是免疫球蛋白，其生物学特性基本相似，推断此试验的结论也应该适用于其他抗体检测试验，实际如何有待进一步验证。

[1] 刘永波，宋春莲，谢相悦，等.云南4 个规模化猪场猪瘟抗体水平监测及免疫效果分析[J].中兽医学杂志，2017，1: 84-86.

[2] 马 琪，韩冬林. 畜禽免疫抗体监测工作存在的问题及对策[J]. 养殖技术顾问，2011，12: 195.

[3] 田肖，纪高华，任友安. 影响动物免疫抗体检测结果的因素分析[J]. 湖北畜牧兽医，2017，38(1): 39-40.

[4] 钟锦辉，张海明，段晓冬，等. 血清冻融次数对猪瘟抗体效价的影响[J]. 广东畜牧兽医科技 ，2013，38(1): 17-19.

[5] 罗承金. 畜禽免疫抗体监测血样采集与血清分离保存技术[J]. 山东畜牧兽医 ，2012，33(2): 48-49.

2016-12-31

赵明娟(1981-)，女，高级兽医师，硕士，从事动物疫病监测和检测研究，E-mail: zmj168_ren@163.com

S852.5

B

0529-6005(2017)07-0095-02