丁型肝炎病毒复制包装载体的构建*

李颖，张五星，周伟，王学军

（1.河北北方学院 研究生部，河北 张家口 075061；2.中国人民解放军第309医院 肾脏内科，北京 100091；3.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850）

丁型肝炎病毒复制包装载体的构建*

李颖1，张五星2，周伟2，王学军3

（1.河北北方学院 研究生部，河北 张家口 075061；2.中国人民解放军第309医院 肾脏内科，北京 100091；3.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850）

目的 构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法 采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3，将构建好的载体转染HuH-7细胞，转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达，质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量；同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果 HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒，并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论 HDV复制包装转座子载体构建成功，为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。

丁型肝炎病毒；载体构建；复制；包装；瞬时转染

丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）是一种缺陷核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，其包装分泌和传播需要乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的帮助，与单独HBV感染相比，HBV与HDV共同感染后会导致肝硬化的速度加快，并使暴发性肝炎和肝细胞癌的发生率提高[1-3]。我国是乙型病毒性肝炎患病大国，与HBV比较，目前缺乏对HDV的全面了解，加强对HDV的深入研究很有必要。

目前HDV的获取方式只有2种：一种是从丁型肝炎患者的血清中直接提取HDV，但是我国丁型肝炎的患者比较少见，若想依赖从血清中直接提取HDV的这种途径不是很理想；另外一种是基于质粒瞬时转染HuH-7肝癌细胞系的HDV包装方法[4]。本研究尝试建立含有HDV复制子和我国HBV流行株C基因型表面抗原表达框的HDV表达载体，实现体外大规模包装，为进一步研究HDV感染复制特性提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

JC126载体（T JOHN 教授馈赠），pHBV1.31（C基因型）（由军事医学科学院放射与辐射医学研究所构建并保存[5]），PB513B-1载体（购自美国System Biosciences公司），HuH-7细胞（购自上海中国科学院细胞库），HepG2细胞（购自美国ATCC公司），HepG2.N9细胞（军事医学科学院放射与辐射医学研究所生物技术实验室构建并保存[6]），含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（购自澳大利亚 Bovogen公司），大肠杆菌DH5α感受态细胞、质粒提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司），限制性内切酶DNaseI（购自美国NEB公司），DNA快速连接试剂盒（D6022）、TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0、Prime ScriptTMRT Master Mix（perfect real time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH plus）及DNA marker DL15000（均购自日本TaKaRa公司），体外转染试剂Gen JetTMVerⅡ（美国SignaGen公司产品），DMEM、MEM、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）、胰酶及双抗（青霉素 -链霉素）等（购自北京中科迈晨科技有限公司），Williams E培养基、驴抗兔Alexa FluorTM594标记二抗及Slow Fade Gold Antifade Mountant with DAPI（购自美国InvitrogenTM公司），兔抗人丁型肝炎病毒δ抗原多克隆抗体由北京泽溪源有限公司制备，引物合成和质粒测序由中美泰和生物技术（北京）有限公司提供服务。

1.2 方法

1.2.1 含HDV复制子的PB转座子载体的构建按常规分子生物学方法操作：以含1.1倍HDV复制子的JC126载体为模板，用引物JC126，正向引物：5-'CACCAATTGATCCTCTAGAGTCGACCCCA-3'，反向引物：5-'GTTACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACC AAG-3'。扩增HDV复制子片段，然后经MfeⅠ-HF和BamHⅠ-HF双酶切后插入线性化的PB513B-1载体（经EcoRⅠ-HF和BamHⅠ-HF双酶切）得到PB126载体；PB126载体依次用NotI-HF和BamHⅠ-HF酶切，然后与含HBV表面抗原表达框的片段（pHBV1.31经BglⅡ和NotⅠ-HF双酶切后回收的约2 800 bp大小片段）相连接得到目标载体PB126I3。质粒经酶切和测序鉴定正确后用于下一步实验。

1.2.2 质粒转染HuH-7细胞 从液氮罐中取出HuH-7细胞，37℃快速解冻，离心后用含10%FBS的DMEM进行培养，培养条件为37℃、5%二氧化碳CO2的孵箱。2 d后观察细胞贴壁且融合程度达到80%，此时细胞生长状态良好，处于对数生长期，将其消化并接种于24孔板或10 cm皿内继续培养，细胞贴壁且融合程度达到70%～80%后，用Gen JetTMVerⅡ体外转染试剂进行质粒转染。

1.2.3 观察增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP） 的 表 达 质 粒 转 染HuH-7细胞48 h后，用普通荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达确定质粒转染是否成功并粗略估计质粒转染效率。

1.2.4 ELISA检测细胞上清乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface，HBsAg）的表达 质粒转染细胞48h后收集细胞上清用HBsAg检测试剂盒进行ELISA检测。细胞上清稀释5倍取75μl加入检测HBsAg的96孔板中，并取试剂盒中的阳性对照和阴性对照各75μl作为对照组，用封片纸覆盖后，放入37℃的孵育箱中孵育60 min；取出反应板，向每孔中加入50μl试剂盒中的HBsAg酶结合物，手工轻轻震荡10 s；用封片纸覆盖后，放入37℃的孵育箱中孵育30 min；取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次，在干净的吸水纸上拍干；洗涤结束后，立即向每个孔中加入50μl的显色剂A和50μl的显色剂B，混匀；手工轻轻震荡10 s；用封片纸覆盖后，放入37℃的孵育箱中孵育30 min；向每个孔中加入50μl的终止液，震荡5 s混匀后；用酶标仪读数，波长450 nm，若需扣除显色剂空白，则先用显色剂空白对照孔校零，然后读取各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定HDV滴度 质粒转染细胞第8.5天收集细胞上清并用0.45μm滤器过滤去除细胞碎片后，用DNaseⅠ在37℃消化1 h，然后用TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0提取上清液中的HDV RNA，通过Prime ScriptⓇRT Master Mix试剂盒将RNA逆转录为互补脱氧核糖核酸（complemen tary deoxyribonucleic acid，cDNA），然后通过 qRTPCR测定HDV滴度，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ检测HDV RNA的拷贝数（HDV正向引物：5'-GGACC CCTTCAGCGAACA-3'；HDV 反向引物：5'-CCTAGC ATCTCCTCCTATCGCTAT-3'）。

1.2.6 HDV病毒浓缩 质粒转染细胞第8.5天后收集细胞上清液，用0.45μm滤器过滤收集的病毒液以去除细胞碎片，按体积比4∶1比例加入25%聚乙二醇 8 000（polyethylene glycol，PEG)，混匀后放于4℃冰箱沉淀过夜，随后4℃条件下12 000 r/min离心40 min，弃上清液，再离心5 min并彻底吸弃上清液，加入一定体积DMEM或Williams E培养基溶解沉淀，分装并置于80℃冰箱中冷冻保存备用。

1.2.7 HDV病毒感染性检测 将生长状态良好的HepG2和HepG2.N9细胞消化后置共聚焦用培养皿中进行培养，24 h后培养基更换为含有2%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），18μg/ml氢化可的松，40 ng/ml地塞米松，10 ng/ml EGF，5μg/ml转铁蛋白，3μg/ml胰岛素，2 mmol L-谷氨酰胺，5 ng/ml亚硒酸钠，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Williams E完全培养基并培养48 h，然后用含4%PEG 8000和500拷贝/细胞的HDV病毒Williams E完全培养基在37℃感染16 h。感染后每48 h更换1次Williams E完全培养基。感染后第7天用免疫荧光检测HDVδ抗原的表达。

1.2.8 免疫荧光方法检测HDVδ抗原 HDV感染细胞第7天后用PBS清洗细胞3遍，加入500μl 4%多聚甲醛固定15min；PBS清洗3遍，加入500μl 0.5%TritonX-100溶液进行常温透膜处理15 min；PBS清洗3遍，加入（2%BSA+5%山羊血清+PBS）混合溶液室温孵育30 min进行封闭；PBS清洗3遍，加入一抗孵育，4℃冰箱过夜；37℃复温10 min，PBS清洗3遍，加入二抗孵育，常温避光1 h；PBS清洗5遍，加入DAPI复染3～5 min；PBS清洗3遍，置于共聚焦荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 6作图软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 含HDV复制子的PB转座子质粒成功构建

原载体SBI513B-1、重组载体PB126和PB126I3经BamHⅠ-HF单酶切后跑胶，大小与预期一致。经进一步的测序验证，PB126I3载体构建成功。该载体采用转座子载体，启动子为CMV，启动子下游为HDV复制子表达框和乙肝表面蛋白表达框；另外该载体还含有eGFP和嘌呤霉素基因，方便转染效率的观察和后续稳定转染细胞的筛选。见图1～3。

2.2 HDV转座子质粒转染48 h后细胞内可见绿色荧光蛋白的表达

质粒转染HuH-7细胞48 h后荧光显微镜下观察到细胞有绿色荧光的表达且亮度较好，转染效率在50%左右，质粒转染成功（见图4）。

2.3 细胞上清HBsAg定性检测结果

质粒转染HuH-7细胞48 h后，转染PB126I3质粒的细胞上清即可检测到较高水平HBsAg的表达，为HDV的包装分泌以及感染传播提供必要的HBV表面蛋白（见图5）。

2.4 细胞上清可检测到较高滴度的HDV RNA

图1 重组载体酶切鉴定

根据文献数据质粒转染HuH-7细胞8.5 d后取细胞上清经DNaseⅠ消化后提取病毒检测HDV RNA的含量，HuH-7细胞转染PB126I3载体后细胞上清可检测到较高滴度的HDV RNA，而转染PB126载体的HuH-7细胞上清HDV RNA非常低，说明HuH-7转染PB126I3组HDV被包装分泌出来，但该HDV颗粒是否具有感染性尚需要进一步验证（见图6）。

图2 PB126I3载体测序代表性图谱

图3 PB126I3的载体示意图

图4 荧光显微镜定性观察绿色荧光蛋白的表达

图5 细胞上清HBsAg的表达 （稀释×5）

图6 细胞上清HDV RNA含量

2.5 瞬时转染所包装分泌的HDV病毒体外具有感染性

通过免疫荧光检测HDV感染HepG2和HepG2.N9细胞7 d后细胞内HDVδ抗原的表达，HDV可特异性地感染表达HBV受体NTCP的HepG2.N9细胞，证明细胞上清浓缩液中含有感染性HDV病毒颗粒（见图7）。

图7 HDV病毒感染细胞后HDVδ抗原的表达

3 讨论

HDV为HBV的卫星病毒，其感染肝细胞、在肝细胞中包装、释放出肝细胞及再感染其他肝细胞均需要HBsAg的帮助，所以HDV的包装分泌只能在有HBsAg表达的细胞内才能进行，体外包装亦需要HDV和编码HBsAg包膜蛋白的质粒共同转染肝细胞[7-10]。自20世纪90年代初以来，已经开发不同的基于cDNA或无cDNA的转染系统用于HDV复制的体外研究，尤其是由M Y KUO等人[11]构建的HDV全基因组三聚体pSVLD3重组质粒被广泛应用于各种HDV的实验中。

本实验在国内外研究基础上成功构建HDV复制包装转座子载体，其含有1.1倍HDV基因组和HBV中国流行株C基因型的HBsAg表达框，该载体经体外转染HuH-7肝癌细胞成功实现HDV体外的复制包装，结果显示转染细胞后细胞上清含有较高滴度的HDV病毒颗粒。

近年科学家发现，钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，Na+/NTCP）是HBV和HDV的重要受体，将NTCP导入HepG2、HuH7等人类肝癌细胞系可实现HBV/HDV的感染复制，极大地改善实验的可重复性[12-13]，本实验室前期成功构建NTCP的稳定转染细胞系HepG2.N9[6]。本研究应用该细胞系成功证明利用本文所构建载体包装分泌的HDV颗粒体外可以有效感染HepG2.N9细胞，证实所包装HDV的体外感染性。该载体的成功构建为进一步研究HDV感染、复制等特性提供前期技术基础。

不过应该考虑到利用瞬时转染技术生产HDV的方法工作量大，实验批次之间的可重复性不够理想。另外以往研究发现，HDV复制对细胞有毒性[14]，到目前为止尚没有一种支持HDV稳定复制包装的细胞系，简单有效地实现HDV的大规模稳定生产还是尚未解决的难题。最近，厦门大学发表基于腺病毒的HDV病毒包装新方法，解决了一定的问题[15]，较早的研究亦发现，HDV可在特定细胞内实现稳定表达[16]。虽然该前期研究结果比较矛盾，但推测通过体外筛选不同的细胞系有可能实现HDV稳定转染细胞系的建立，用于HDV的大规模生产和抗HDV病毒潜在药物评价，而本文所构建的HDV复制包装转座子载体为未来HDV稳定转染细胞系建立提供前期基础和有力保障。

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Construction of hepatitis D virus replication vector*

Ying Li1,Wu-Xing Zhang2,Wei Zhou2,Xue-Jun Wang3
(1.Graduate Faculty,Hebei Northern College,Zhangjiakou,Hebei 075061,China;2.Department of Nephrology,the 309th Hospital of PLA,Beijing,100091,China;3.Institute of Radiation Medicine,Military Academy of Medical Sciences,Beijing,100850,China)

ObjectiveTo construct a transposon vector for hepatitis D virus(HDV)replication and packaging.MethodsThe piggyBac(PB)transposon vector PB126I3 containing HDV replicon and hepatitis B virus surface antigen (HBsAg)expression cassette was constructed by using standard molecular cloning methods.HuH-7 cells were transfected with the vector PB126I3.The expression of green fluorescent protein(GFP)was observed by fluorescence microscopy,and the HBsAg expression level in cell medium was detected by ELISA 48 hours after transfection.HDV RNA in cell supernatants was extracted and detected by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)8.5 days after transfection.Meanwhile,HDV particles in cell medium were concentrated and infected the HepG2.N9 cells which were stably transfected with HBV receptor NTCP.The cellular expression of HDV δ antigen was detected by immunofluorescence 7 days after infection.ResultsHuH-7 cells were successfully transfected by the vector PB126I3,and secreted a large number of HBsAg and HDV particles in cell medium.HDV δ antigen was detected obviously in HepG2.N9 cells 7 days after HDV infection.ConclusionsHDV replicon vector PB126I3 were successfully constructed for HDV replication and packaging,which will promote the large-scale of HDV production and HDV transgenic hepatocyte cell line establishment in the future.

hepatitis D virus;vector construction;replication;packaging;transient transfection

R516.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.006

1005-8982（2017）11-0031-05

2017-03-03

国家863青年科学家项目（No：2015AA020946）；北京市科技新星项目（No：Z171100001117119）

王学军，E-mail：xjwang@bmi.ac.cn