沉默中期因子对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

刘晶华，邹玉，吴钧，常巍

（1.云南省第二人民医院 消化内科，云南 昆明 650001；2.云南省昆明市第一人民医院 神经外科，云南 昆明 650031；3.昆明医科大学统计教研室，云南 昆明 650000）

临床研究·论著

沉默中期因子对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

刘晶华1，邹玉3，吴钧2，常巍1

（1.云南省第二人民医院 消化内科，云南 昆明 650001；2.云南省昆明市第一人民医院 神经外科，云南 昆明 650031；3.昆明医科大学统计教研室，云南 昆明 650000）

目的 探讨中期因子（MDK）在肝细胞肝癌（HCC）中的表达及对肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法 选取2015年1月-2016年10月该院收治的50例肝癌患者组织标本，免疫组织化学染色分析组织中MDK的表达。利用沉默核糖核酸（siRNA）沉默人肝细胞癌HepG2细胞内MDK表达，分别采用CCK-8、流式细胞仪及插入式细胞培养皿、穿透小室（Transwell）检测沉默MDK后HepG2细胞增殖、凋亡及侵袭能力变化。结果 肝癌组织中MDK蛋白的表达水平较癌旁组织提高（χ2=19.643，P=0.000）；在HepG2细胞中，沉默MDK的表达可抑制HepG2细胞增殖（F=22.204，P=0.037）和侵袭（t=5.611，P=0.008）能力，并提高HepG2细胞的凋亡比例（t=5.702，P=0.006）。结论 MDK在肝癌中表达升高，沉默肝癌HepG2细胞内MDK表达能够抑制肝癌细胞生长和侵袭。

中期因子；肝细胞癌；增殖；凋亡；侵袭

原发性肝癌包括肝细胞性肝癌、胆管细胞性肝癌和混合性肝癌等多种病理类型[1]。目前，我国原发性肝癌的病理类型以肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）为主[2]。以外科手术为主，配合介入化疗及生物靶向治疗的综合治疗方案对各临床分期的肝细胞癌患者均有一定的疗效。但总体来看，患者治疗后复发率较高，导致患者的5年生存率仍然很低[3]。在传统治疗方法渐入瓶颈之时，寻找新的基因治疗靶点有可能为肝细胞癌的治疗打开一个新的思路。

中期因子（midkine，MDK）是一种分泌型肝素结合生长因子。MDK由11号染色体p11.2位点上的基因编码，成熟的MDK分子量较小仅为14 kD[4]。近年来研究发现，MDK作为肿瘤微环境中的重要效应因子之一，在胃癌[5]及乳腺癌[6]中均呈现高表达状态，对肿瘤细胞的增殖和侵袭行为均有一定的促进作用。然而，MDK在肝细胞癌中的临床意义及生物学功能尚不完全明确。

本研究通过免疫组织化学染色、CCK-8（cell counting kit-8）、流式细胞仪及插入式细胞培养皿、穿透小室（Transwell）侵袭小室模型，检测MDK在HCC组织中的表达及其对HCC细胞生长和侵袭的影响，以期为研究MDK在肝癌诊治中的价值提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 材料

选取2015年1月-2016年10月本院普通外科收集50例肝癌及对应癌旁组织（距切缘＞2 cm）保存。其中，男性37例，女性13例；年龄36～67岁，中位年龄51岁。人肝细胞癌细胞系HepG2（购自中国科学院上海生物化学研究所细胞保种库），DMEM（dulbecco's modified eagle medium）（货号：11965-084）和胎牛血清（货号：16000044）（均购自美国Gibco公司），CCK-8细胞增殖检测试剂盒（货号：E606335）和Annexin V凋亡检测试剂盒（FITC/PI双染法，货号：E606336）（购自上海生工生物工程有限公司），Trizol试剂（货号：15596026）、LipofectamineTM3000转染试剂（货号：L3000015）、MDK特异性沉默核糖核酸（silencing ribonucleic acid，siRNA）（货号：AM16708）、阴性对照 siRNA（货号：4404021）、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒（Super Script One-StepRT-PCR System withPlatinum Taq DNA Polymerase，货号：10928042）及实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 试剂盒 （DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit，货号：F415L）（购自美国英伟杰公司），MDK抗体（货号：ab52637）及β-actin抗体（货号：ab8226）（购自美国Abcam公司），电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）试剂盒（货号：WBK LS0050）（购自美国密理博公司），8.0μm孔径Transwell小室（货号：#3458）（购自美国康宁公司），基质胶（货号：354230）（购自美国BD公司），MDK及βactin qRT-PCR引物序列（见附表）。

附表 qRT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 石蜡包埋的标本组织切片常规进行脱蜡及水化预处理：用抗体稀释液按1∶100比例稀释兔抗人MDK多克隆抗体，滴加抗体于组织切片上并充分浸没组织标本；4℃恒温冰箱内孵育过夜，洗净未结合一抗后，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗结合相应一抗，二氨基联苯胺法显示阳性蛋白。400×视野下每张组织切片下随机选取10个视野进行阅片。若有＞10%的癌细胞胞核呈棕黄色或棕褐色染色即为阳性，否则判定为阴性。

1.2.2 细胞培养及siRNA转染 HEPG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至稳定传代2、3代。按过夜增殖至愈合度达70%之密度接种6孔细胞培养板。达到预定培养密度后移除培养基，1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶液充分洗涤细胞。转染分组：si-MDK组每孔加入100 pmol的MDK siRNA及5 μl转染试剂；对照组每孔加入100 pmol的阴性对照siRNA及5 μl转染试剂。添加无血清DMEM培养液至终体积2 ml每孔并培养6 h。移除原有培养基更换新培养基继续培养。

1.2.3 qRT-PCR 细胞总核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）经由Trizol试剂提取。按逆转录及qRT-PCR说明书要求进行逆转录及扩增反应。采用2-△△Ct法计算MDK信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的相对表达量。

1.2.4 蛋白免疫印迹检测 提取转染72 h后的HEPG2细胞总蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，采用BIO-RAD湿转系统（美国Bio-Rad公司），70 V恒压转膜150 min，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h；用3%浓度的脱脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀释的MDK及肌动蛋白（β-actin）抗体，4℃下孵育过夜。用5%脱脂奶粉溶液按1∶5 000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或抗鼠二抗，室温孵育条带1 h。于暗室内，ECL法观察蛋白表达。

1.2.5 CCK-8检测 分别收集转染0、24、48及72 h后的HepG2细胞，采用完全培养基重悬后在96孔板内以每孔5000个/100μl均匀接种。过夜培养后每孔加入10 μl CCK-8溶液避光培养2 h，吸净上清液，酶标仪读取450 nm波长处每样本的光密度（optical density，OD）值。每个样本独立重复实验3次。

1.2.6 细胞凋亡检测 结合缓冲液（binding buffer）（1×）重悬转染72 h后的HEPG2细胞并调整细胞密度为2×105个/ml，取195 μl细胞悬液加入流式上样管中，同时加入5 μl Annexin V-FITC避光反应15 min，再次原管重悬细胞后加入10 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）避光孵育 15 min，＜1 h 于流式细胞仪上进行检测。

1.2.7 细胞侵袭检测 收集转染72 h后的HepG2细胞，采用无血清DMEM重悬细胞并调整密度为2×105个/ml，备用。用无血清DMEM培养基按1∶8比例稀释基质胶，取适量基质胶充分包被小室膜上室面。包被好的小室在37℃风干1 h后，上室内加入100μl细胞悬液。24孔板内每孔加入750μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，将小室妥善放于24孔板中。于培养箱内培养24 h后洗净小室内培养基，4%多聚甲醛固定小室膜上细胞，结晶紫染色小室膜10 min，PBS冲洗多余染液。棉签仔细擦除上室面细胞，正置显微镜下观察侵袭细胞数目。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间非连续变量资料的比较用χ2检验，肝癌与癌旁组织的对比则用配对四格表χ2检验；组间比较用两独立样本t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDK在肝癌组织及癌旁组织中的表达

对50例肝癌及癌旁组织中进行免疫组织化学染色发现，MDK主要于细胞浆中（见图1）。有78.00%（39/50）的肝癌组织中MDK蛋白为阳性，而仅有34.00%（17/50）的癌旁组织中MDK蛋白阳性表达，两者差异有统计学意义（χ2=19.643，P=0.000）。

2.2 沉默MDK表达对HepG2细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

通过siRNA转染特异性调低MDK mRNA（t=11.302，P=0.000）（见图 2A）及蛋白（t=3.271，P=0.034）（见图2B）的表达水平。通过CCK-8增殖分析检测证明，沉默MDK能抑制HepG2细胞增殖（F=22.204，P=0.037）（见图2C）。流式细胞仪检测细胞凋亡结果表明，下调MDK表达后，HepG2发生凋亡的细胞比例大幅升高[（23.614±4.331）vs（12.035±1.204），t=5.702，P=0.006]（见图2D）。采用Transwell检测沉默MDK表达后HepG2细胞的侵袭能力发现，低表达MDK的HepG2细胞侵袭过基质胶的数目降低，说明沉默MDK抑制HepG2的侵袭[（22.547±4.361）vs（11.135±3.204），t=5.611，P=0.008]（见图2E）。

图1 MDK蛋白在肝癌组织中的表达 （100 μm）

图2 沉默MDK表达对HepG2细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

3 讨论

MDK高表达主要出现在胚胎发育过程中，而出生后组织内的表达水平十分低[7]。目前在成年机体内，仅肾脏和小肠上皮组织表达MDK分子[8]。然而，在包括组织缺血[9]、炎症[10]及肿瘤等[11]许多病理过程中，MDK常出现表达增加的情况，且高表达的MDK分子常与疾病进展相关。由于生理上，MDK具有促进生长及分化调节因子，因此在人类胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的研究中发现，过表达MDK对胰腺癌细胞增殖及迁移具有明显的促进作用[12]，而且临床研究结果表明MDK是PDAC患者预后评价指标之一。

总之，笔者通过对50例肝癌患者的检测发现，MDK在肝癌组织中表达量高于癌旁组织。目前，入组患者正在接受临床随访，随访结束后笔者将进一步根据患者的生存情况，对MDK表达及患者的临床病理特征进行多因素回归分析，以期进一步明确上述因素对肝癌患者预后的影响。在人工调低MDK在肝癌细胞中的表达后，恶性程度较高的肝癌HepG2细胞的增殖、侵袭均受抑制而细胞凋亡却提高。因而，笔者推断MDK是一种重要的癌蛋白，在促进肿瘤生长转移等方面具有重要作用。但是目前许多分子治疗靶点都存在特异性不强、副作用大等缺点。在体内，如何靶向下调肝癌细胞中MDK的表达将成为MDK研究的热点和挑战之一。

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Effect of midkine knockdown for malignant biological feature in human hepatocellular carcinoma

Jing-hua Liu1,Yu Zou3,Jun Wu2,Wei Chang1
(1.Department of Gastroenterology,Second People's Hospital of Yunnan Province,Kunming,Yunnan 650001,China;2.Department of Neurosurgery,Kunming First People's Hospital,Kunming,Yunnan 650031,China;3.Department of Statistics,Kunming Medical University,Kunming,Yunnan 650000,China)

ObjectiveTo study the expression and roles of midkine (MDK)in human hepatocellular carcinoma(HCC).MethodsA total of 50 HCC tissues and tumor adjacent tissues were collected to detect the expression of MDK by immunohistochemical staining.The expression of MDK in HepG2 cells was silenced by siRNA.Cell proliferation,apoptosis and invasion were detected by CCK-8,flow cytometry and Transwell,respectively.ResultsMDK expression was up-regulated in HCC tissues (P＜0.05).Knockdown MDK in HCC cells was significantly down-regulated cell proliferation,invasion and induced apoptosis.ConclusionsMDK is over-expressed in HCC tissues.Knockdown MDK can inhibit growth and invasion on HepG2 cells.

MDK;hepatocellular carcinoma;proliferation;apoptosis;invasion

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.007

1005-8982（2017）11-0036-05

2017-06-17

常魏，E-mail：1397978466@qq.com