雷公藤红素对IL-1β致软骨终板退变的影响

陈荣国 孙强 曾怿 王书奎

1．南京中医药大学第三附属医院，南京市中医院骨科，江苏南京210001

2．南京医科大学附属南京医院孙强(骨科 中心实验室)，江苏南京210006

3．南京市六合人民医院骨三科，江苏南京211500

椎间盘退变是导致腰椎间盘突出症、颈椎病等临床常见椎间盘退变性疾病的根本原因。椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板三部分组成，其中，软骨终板在营养运输、调控椎间盘内压和稳定椎间盘结构等方面起着重要作用，软骨终板退变会导致其营养运输功能减退、椎间盘营养供给不足，减低椎间盘内压、破坏椎间盘整体结构的稳定性，从而进一步促进椎间盘整体退变［1］。炎性因子在促进软骨终板退变中扮演着重要角色，其中白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)是最主要的炎性因子之一，IL-1β作用于软骨终板细胞，可刺激软骨终板细胞产生和分泌金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，MMPs家族中的MMP-1能够降解纤维胶原，MMP-3能够分解和破坏细胞外基质，以上物质共同作用于软骨终板细胞，抑制作为软骨基质的蛋白多糖和II型胶原的合成以及促进其分解，从而加速软骨终板的退变。

雷公藤红素是雷公藤片、雷公藤多甙片等制剂的有效成分之一，是一种具有多种生物活性的天然产物，因其具有显著的抗炎活性，而被广泛应用于类风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮等疾病的治疗［2］，但是雷公藤能否抑制IL-1β对软骨终板细胞的影响，目前尚缺乏相关研究报道。本研究主要拟通过体外培养小鼠软骨终板细胞，探讨雷公藤红素能否抑制IL-1β介导的软骨终板细胞退变及其可能的作用机制，为椎间盘退变的临床治疗研究提供一个新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

雷公藤红素(Sigma公司，美国);重组人细胞因子IL-1β(Peprotech公司，美国);CCK-8试剂盒(凯基公司，中国);TRIzol(Invitrogen公司，美国);逆转录试剂盒及SYBR Green Mixture(TaKaRa公司，日本);小鼠MMP-1、MMP-3 ELISA试剂盒(上海高创化学科技有限公司，中国);96孔反应板(ABI公司，美国);PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成 (蛋 白 多 糖:Forward Primer 5’-TGATGCTGTATTGGCTGCACC-3’ReversePrimer 5’-CTACATGGTTGTCAGGAATGTGT-3’;II型胶原:Forward Primer 5’-TGGACGATCAGGCGAAACC-3’ReversePrimer5‘-GCTGCGGATGCTCTCAATCT-3’);PCR反应仪器为ABI 7500型PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 软骨细胞的分离、培养:颈椎脱臼法将小鼠处死后，无菌条件下取下整个腰椎，解剖显微镜下剥离包裹软骨组织的筋膜和肌肉显露椎间盘，分离软骨终板，经磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)数次冲洗后剪碎，再加入0.2%的II胶原酶3 mL，并移入消化瓶里，37℃恒温消化3～4 h，待大部分细胞游离时，经过滤、收集、离心、弃上清后加入完全培养基(10%胎牛血清、25 mmol/L HEPES、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)，吹打、混匀制成单细胞悬液，接种于6 cm培养皿中，置于37℃、5%的CO2细胞培养箱中孵育，48 h后更换培养液，将未贴壁的细胞团块弃去，之后每48 h更换1次培养液，将该代细胞标记为P0代细胞，当培养皿内细胞生长融合度达80%时传代，取对数期生长的P2代细胞进行实验。

1.2.2 雷公藤红素对软骨终板细胞增殖的影响:取无血清 DMEM培养基(Dulbecco＇s modified eagle medium)稀释细胞(2×103/mL)接种于96孔板，分别用含0、0.1、0.25、0.5、1.0 μmol/L 雷公藤红素的无血清DMEM处理细胞24、48 h和72 h，然后分别加入每孔10 μL CCK-8试剂，孵育1.5 h后，以荧光分光光度仪检测每孔吸光值。将细胞存活率＞70%的实验组相对应的雷公藤红素浓度定为无细胞毒性浓度，用于后续实验研究。

1.2.3 雷公藤红素对软骨终板细胞MMP-1、MMP-3蛋白表达的影响:将P2代细胞按2×105/孔接种于6孔板，实验分组为:空白对照组(无血清DMEM培养基);IL-1β诱导组(IL-1β 5 ng/mL共同孵育2 h);雷公藤红素干预组(经IL-1β诱导后，再以雷公藤红素共同孵育24 h)。ELISA法检测细胞上清液中MMP-1、MMP-3的水平。

1.2.4 雷公藤红素对软骨终板细胞的蛋白多糖、II型胶原转录表达的影响:将P2代细胞按2×105/孔接种于6孔板，实验分组为:空白对照组(无血清DMEM培养基);IL-1β诱导组(IL-1β 5模范ng/mL共同孵育2 h);雷公藤红素干预组(经IL-1β诱导后，再以雷公藤红素共同孵育24 h)。提取总RNA，RT-qPCR法测定软骨终板细胞蛋白多糖、II型胶原mRNA的表达。

1.3 统计学处理

数据均以均数±标准差表示，统计分析均采用SPSS20.0统计学软件进行数据处理分析，采用独立样本t检验或方差分析比较各组各项观察指标的统计差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤红素对软骨终板细胞增殖的影响

以不同浓度的雷公藤红素分别处理软骨终板细胞24、48 h 及72 h，0.1 μmol/L 和 0.25 μmol/L 的雷公藤红素在各个时间点对软骨终板细胞增殖无明显抑制作用。但雷公藤红素1.0 μmol/L在24 h、0.5 μmol/L在48 h能明显抑制细胞增殖，表明大剂量雷公藤红素对软骨终板细胞有一定毒性作用。因此，本实验选用0.25 μmol/L作为进一步研究用剂量，以保证雷公藤红素对细胞增殖的影响最小(图1)。

2.2 雷公藤红素对软骨终板细胞MMP-1、MMP-3蛋白表达的影响

以5 ng/mL的 IL-1β刺激 2 h，再经过 0.25 μmol/L雷公藤红素干预24 h后，以ELISA法检测MMP-1和MMP-3的蛋白表达水平(图2)。结果显示，MMP-1、MMP-3经过IL-1β刺激后明显升高，当雷公藤红素干预后，其水平明显下调，与空白对照组无明显差异。

2.3 雷公藤红素对软骨终板细胞的蛋白多糖、II型胶原转录表达的影响

图1 不同浓度雷公藤红素对软骨终板细胞增殖的影响Fig．1 Effects of different concentrations of celastrol on the proliferation of chondrocytes of the endplate

图2 雷公藤红素对MMP-1、MMP-3蛋白表达的影响*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001Fig．2 Effects of celastrol on the protein expression levels of MMP-1 and MMP-3(*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001)

以5 ng/mL的 IL-1β刺激 2 h，再经过 0.25 μmol/L雷公藤红素干预24 h后，以RT-qPCR检测蛋白多糖、II型胶原mRNA表达水平(图3)。结果发现，蛋白多糖、II型胶原mRNA的表达随着IL-1β的刺激被显著抑制，当雷公藤红素干预24 h后，其mRNA水平明显被逆转。

3 讨论

椎间盘是由纤维环、髓核和软骨终板构成。软骨终板是椎间盘结构和功能的重要组成部分，也是椎间盘营养物质转运和代谢产物排泄的重要通道，具有维持椎间盘正常形态和结构、缓冲外界压力负荷的作用，因此，椎间盘软骨终板的退变是椎间盘退变的始发阶段，与多种复杂因素密切相关。

图3 雷公藤红素对蛋白多糖和II型胶原的mRNA水平的影响(＊＊＊P ＜0.001)Fig．3 Effects of celastrol on the mRNA expression levels of proteoglycan and type II collagen(＊＊＊P ＜0.001)

IL-1β是由破骨细胞、软骨细胞等多种细胞分泌，退变软骨细胞IL-1β异常高表达［3］。IL-1β可通过促进MMPs和一氧化氮的合成来加速细胞退变，同时也可通过其他炎性介质来影响椎间盘细胞的继发性病理改变［4］。蛋白多糖和II型胶原是构成软骨终板细胞基质的主要成分。当软骨终板细胞发生退变后，二者表达降低，影响其细胞功能［5］。金属蛋白酶(MMPs)主要参与细胞基质的代谢过程。先前的研究［6］显示，IL-1β在诱导正常软骨终板细胞后，细胞蛋白多糖、II胶原表达水平减少，MMP-1及MMP-3的表达相应增多。本研究结果表明，在原代培养小鼠软骨终板细胞中，IL-1β可促进其细胞的MMP-1及MMP-3表达升高，并抑制蛋白多糖、II胶原表达水平，这与上述研究结果相一致。

雷公藤红素来源于中药雷公藤的根皮之中，是雷公藤的一个单体小分子化合物。众多研究揭示雷公藤红素具有抗癌、抗炎、免疫抑制、抑制血管生成、诱导细胞凋亡等作用［7］。先前研究［8］表明，雷公藤红素可通过抑制NF-κB p65蛋白表达、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)及 IL-1β mRNA表达，从而对大鼠结肠炎具有保护作用。有学者［9］通过研究雷公藤红素对小鼠的免疫抑制作用及对细胞因子IL-6 mRNA表达的影响，得出的结论为雷公藤红素在一定程度上能抑制小鼠的免疫功能，能抑制炎症细胞因子IL-6基因的过度表达。有实验证实雷公藤红素对胶原性关节炎有治疗作用［10］。另一研究［11］显示，在 IL-1β 刺激体外培养的人关节软骨细胞后，雷公藤红素能够明显抑制金属蛋白酶、诱导性一氧化氮等的产生和分泌，在一定程度上阻止关节软骨的退变。而软骨终板细胞是软骨细胞的一类，其表型与关节软骨类似，因此，本研究通过体外培养原代软骨终板细胞以探讨雷公藤红素对IL-1β介导的软骨终板细胞退变的抑制作用。结果发现，雷公藤红素可逆转IL-1β对软骨终板细胞的效应，抑制MMP-1及MMP-3表达水平，并促进蛋白多糖、II胶原表达水平，这表明雷公藤红素可有效抑制IL-1β介导的软骨终板细胞退变。

综上所述，本研究证实了雷公藤红素可以有效抑制IL-1β对软骨终板细胞的影响，可能在IL-β介导的椎间盘软骨终板退变中发挥阻断作用，为治疗椎间盘退变性疾病提供新的方法和思路。