银杏达莫预处理对乳鼠离体脑片谷氨酸损伤的保护作用

陈广福

银杏达莫预处理对乳鼠离体脑片谷氨酸损伤的保护作用

陈广福

目的 探讨银杏达莫预处理对乳鼠离体脑片谷氨酸损伤的保护机制。方法 取出生7天的SD乳鼠脑皮质制备离体脑片，用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色判断脑片活性后按随机法分为正常对照组（A组）、谷氨酸（Glu）损伤组（B组）、银杏达莫预处理损伤组（C组），C组于培养3天时进行药物预处理24 h（银杏达莫注射液浓度为40μg/ml）；脑片培养至4天时用1 mmol/L Glu复制损伤模型，损伤30 min后将3组转入正常培养液中孵育至7天。A组不予任何处理。观察脑片细胞形态学变化，尼氏小体计数，碘化丙啶（PI）染色比例。结果 （1）脑片形态学观察：3天肉眼可见脑片轻度水肿，3～5天水肿逐渐消失，6天镜下见典型的神经细胞及少量胶质细胞；7天细胞生长最旺盛，之后凋亡逐渐占据主导。（2）苏木素-伊红（HE）染色观察细胞形态：A组神经元呈多边或梭形；B组较A组明显减少；C组神经元数量介于A组与B组之间，且组间存在差异。（3）尼氏体染色：A组尼氏小体清晰可见；B组尼氏小体阳性细胞数较A组明显减少，而C组介于A组与B组之间，（4）PI（碘化丙啶）染色：A组细胞几乎全部呈现胞核红色荧光；B组荧光明显减少、C组大量神经元出现荧光，轮廊不清。结论 银杏达莫预处理对乳鼠离体脑片的Glu损伤有保护作用。

脑片；预处理；银杏达莫；保护作用

当前缺血损伤机制和缺血性损伤的“瀑布效应”是医学研究领域中的热点之一，主要与脑细胞钙超载、氧自由基的损害、能量耗竭、酸中毒、兴奋性氨基酸的毒害作用有关[1]，既往研究结果表明，在脑缺血不同时间窗口期应用神经保护剂促进损伤组织向正常组织修复转化，脑组织药物预处理是通过药物激发或模拟机体自身内源性保护物质而出现脑保护效应，这可能与国外报道中讲述的细胞胞体与轴突的损伤恶性循环有关[2]。目前银杏达莫的脑保护作用受到国内外的关注，相关实验主要在神经细胞和在体动物中展开，然而在离体脑片水平的研究少见报道。因此，本研究采用皮质脑片培养建立谷氨酸（Glu）损伤模型，从脑片水平研究药物的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

选择出生7天的SD乳鼠，动物合格证号：SCJK（闽）2016-002。DMEM/F-12培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司），银杏达莫注射液（批号H52020032贵州益佰制药股份有限公司），其余染色试剂[碘化丙啶（PI）日本Solarbio公司]均为市售分析纯试剂。

1.2 乳鼠皮质脑片体外培养

参照本课题组前期报道方法体外培养SD乳鼠皮质脑片。将乳鼠去脑壳取脑，剥除软脑膜，切成400～500μm脑片，一部分用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，一般均为红色，若出现淡染区将这批脑片丢弃不用，将脑片活性好的放入6孔板内培养，保持脑片在气液界面上生长，第2天换液1次，以后每2天换1次，每次换液1.2 ml。脑片培养基成分：DMEM/F-12培养液85 ml+灭活无菌胎牛血清15 ml+双抗溶液（10 kU/ml青霉素和10 kU/ml链霉素）1 ml，调节pH值至7.4。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.3 实验分组与模型的建立

将生长至3天的脑片按随机数字表法分为正常对照组（A组）、Glu损伤组（B组）、银杏达莫预处理损伤组（C组）3组，每组12片。B组、C组分别采用1mmol/L Glu建立损伤模型，C组于损伤前给予40μg/ml银杏达莫预处理24 h。各组操作完毕移入正常培养液中继续孵育至7天。A组不给予任何处理。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 脑片形态学观察 每次换液前在倒置显微镜观察脑片活性、生长状况及污染情况。

1.4.2 细胞形态学观察 石蜡切片脱蜡后进行HE染色。在倒置显微镜下观察3组脑片细胞形态学变化。

1.4.3 尼氏体染色 石蜡切片脱蜡后用1.2%甲苯胺蓝染色，中性树胶封片。每组选5张切片，在高倍视野下随机取不重叠的5个视野，计数尼氏小体。

1.4.4 PI染色 取各组培养至7天的脑片，在培养液中加入50 μL的PI溶液染色30 s，荧光显微镜下（40×物镜，6.4×目镜）观察各组脑片细胞的红染色比例。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 脑片形态学观察

培养3天肉眼见脑片微水肿，边缘变薄呈半透明，贴于透膜上，镜下见脑片中心出现少量自然凋亡细胞；3～5 天水肿逐渐消失，边缘细胞逐渐增多，形态不典型；6天镜下见较多典型的神经细胞；7天细胞生长达到高峰。

2.2 细胞形态学观察

A组脑片细胞层次清楚，HE染色后神经元呈梭形或多棱形，数量较多，膜完整，胞体红染，胞核清晰，形状不规则的胶质细胞围绕细胞周边（图1a）；B组脑片不清晰，染色后细胞数量较A组明显减少，胞膜边缘不清，多数胞核固缩，细胞水肿，部分胞体见脱核现象，呈空泡样或皱缩变形（图1b）；C组神经元数量介于A组与B组之间，大多细胞形态典型，部分细胞出现水肿，胞膜较完整，未见细胞脱核，胞质红染较为均匀（图1c）。

图1a

图1b

图1c

2.3 尼氏体染色结果

尼氏体染色结果见图2、表1：A 组染色后尼氏小体清晰可见，神经元数量多（图2a）；B 组染色后阳性细胞数较A 组明显减少（均P＜0.05），尼氏小体丢失现象，形状变异大，染色后胞质出现空泡（图2b）；C组染色后尼氏小体数量较B 组明显增多，尼氏小体聚集在细胞核周围，染色均一，尼氏小体丢失现象，出现胞质空泡（图2c）。

图2a

图2b

图2c

表1 各组脑片尼氏体细胞阳性细胞数比较

2.4 PI染色结果

图3a

图3b

图3c

A 组荧光显微镜下观察，荧光红色显色少，零星出现几个红色荧光点，死亡和凋亡细胞数量少（图3a）；B组大面积出现荧光红色散点图，红色荧光点密度密集，说明死亡和凋亡细胞数量明显增多（图3b）；C组出现荧光红色散点图有所减少，红色荧光点密度稀薄，介于A组和B组之间，死亡和凋亡细胞数量有所减少（图3c）。

3 讨论

脑缺血再灌注I/R损伤是复杂的病理过程，包括缺血期原发性损伤和再灌注期继发性损伤，其中细胞凋亡在继发性脑细胞死亡中起着关键作用。缺血再灌注损伤机制可能[3]：兴奋性氨基酸毒性作用；自由基损伤；细胞内钙超载；能量代谢障碍及酸中毒；细胞凋亡；炎症免疫反应蛋白酶激活；线粒体功能异常；蛋白合成及基因表达的变化等等。研究表明，采取适度脑缺血预处理可改善缺血性损伤所引起的神经元损害[4-5]。而药物的预处理是在缺血预处理的理论基础上，通过药物模拟缺血预处理作用，对脑I/R损伤具有保护作用，可减轻炎症反应，激活酶活性，清除自由基，减少钙超载等[6]，具有很好的临床研究价值。本实验采用离体脑片培养，建立相对的药物损伤预处理的模式，并根据I/R的发病机制中的兴奋性氨基酸大量释放学说，用高浓度模拟脑缺血建立I/R模型。从检测酶学指标及形态学免疫荧光等观察比较研究。体外培养的神经元可按实验需要控制其生长条件，便于直接观察细胞形态、生化改变，其培养条件及在科研领域的应用已日趋成熟[7]。脑片标本实际上是一种短时间离体移植培养的制备技术兼备有在体脑实验和离体神经细胞培养的某些特点，现在利用微孔膜培养脑片操作简单，神经元存活时间长并且有良好细胞反应性。在神经元代表培养的基础上，20世纪脑片技术得以发展，并用于电生理学、生物化学、病理生理、药理学、分子生物学等诸多领域，因此国内外实验室被广泛采用[8]。离体脑片实验介于整体和细胞水平之间，既有相对完整的形态结构和细胞间相互关系，又能在体外人工控制实验条件[9]。

银杏达莫是第四代银杏叶提取物加入双嘧达膜的复合制剂，主要成分是银杏黄酮甙、银杏苦内酯、白果内酯和双嘧达莫等，银杏达莫具有拮抗血小板活性因子（PAF），抑制血小板的活化与聚集，降低血粘度；清除氧自由基，防止自由基对神经细胞的损伤，抑制自由基诱导的神经细胞调亡；改善微循环，增强红细胞变形能力，降低血液粘滞度；刺激前列环素和内皮舒张因子，抑制细胞内钙超载；抑制血小板的第一相和第二相聚集，抗血栓形成[10]。目前国外文献很少有报道银杏达莫相关研究，但是在国内有大量的动物实验和临床实验的研究。银杏达莫直接保护神经元，加强神经传导、加快神经递质的更新，改善组织代谢，稳定细胞膜、维持正常的细胞结构和功能，降低缺血粘度、抑制血小板和红细胞的高聚集性、增加红细胞的变形性，扩张动脉血管、降低血管壁通透性、改善水肿，增强细胞对缺血缺氧的耐受性。其脑保护作用已经得到大量基础与临床研究的证实。研究表明，银杏达莫可减轻脑I/R 损伤，可选择性的高效清除细胞外液中的氧自由基，抑制脂质过氧化，减轻细胞膜的损伤[11]。体外研究表明，银杏达莫可减轻脑缺血造成的细胞外谷氨酸的堆积。本实验采用的银杏达莫浓度是以往脑片细胞损伤保护实验中的最佳保护浓度。本实验结果与损伤组比较，银杏达莫预处理组细胞存活率有明显提高，光镜下细胞形态大体正常，尼氏小体丢失减少，PI的红染比例明显下降，说明银杏达莫可能通过多个方面起到脑保护作用。一方面，银杏达莫通过还原作用灭活自由基，抑制脂质过氧化反应，维持细胞膜和线粒体功能稳定，对I/R 损伤具有保护作用[12]；另一方面，银杏达莫抑制兴奋性氨基酸介导的钙离子内流，阻断Glu的兴奋性效应，起到脑保护作用[13]；同时可抑制线粒体内膜的渗透性转运孔道开放，维护线粒体产能，抑制I/R 损伤。有关具体药物成分的保护机制有待进一步探讨。对于一种损伤，银杏达莫预处理在细胞形态学、凋亡率、尼氏小体计数等方面可能存在差异，相关机制仍需进一步实验。

综上所述，银杏达莫24 h预处理皮层脑片可减轻Glu损伤，银杏达莫的保护作用其有关机制尚待进一步研究。

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Protective Effects of Ginkgo Leaf Extract and Dipyridamole Pretreatment on Glutamate Injury in Neonatal Rat Brain Slices

CHEN Guangfu Anesthesiology Department, Fuzhou Second Affiliated Hospital of Xiamen University, Fuzhou Fujian 350007, China

Objective To study the protective mechanism of ginkgo leaf extract and dipyridamole pretreatment on glutamate injury in neonatal rat brain slices. Methods The isolated brain slices of SD rats were collected and stained with 2,3,5-triphenyltetrazole (TTC) to determine the activity of brain slices. The rats were divided into normal control group (group A), glutamate (Glu) injury group (group B), ginkgo leaf extract and dipyridamole pretreatment injury group (group C), group C was cultured for 3 days for 24 hours (ginkgo dipyrass injection concentration of 40μg/Ml). Brain slices were cultured for 4 days and then damaged with 1 mmol/ L Glu. After 30 minutes of injury, the three groups were transferred to normal culture medium for 7 days. Group A did not handle any treatment. To observe the morphological changes of brain cells, the number of Nissl bodies, the ratio of propidium iodide (PI) staining, Results (1) brain tablets morphological observation: 3 days the brain can be seen mild brain edema, 3 to 5 days of edema gradually disappeared, 6 days under the microscope to see the typical nerve cells and a small amount of glial cells; 7 days the most vigorous growth of cells, followed by apoptosis gradually dominated. (2) Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the morphological changes: the neurons in group A were polygonal or fusiform; group B was signifcantly lower than group A; the number of neurons in group C was between group A and group B difference. (3) Nissl body staining: group A neonatal body is clearly visible; B group of Nissl body positive cells than the A group was significantly reduced, and C group between the A group and B group, (4) PI (propidium iodide) Staining in group A showed that red fluorescence was almost all in group A; fluorescence was signifcantly reduced in group B, and fuorescence was observed in large groups of neurons in group C. Conclusion Ginkgo leaf extract and dipyridamole pretreatment had protective effect on Glu injury in neonatal rat brain slices.

brain slices; pretreatment; ginkgo leaf extract and dipyridamole; protective effect

R743

A

1674-9316（2017）16-0146-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．16．080

福建省福州市科技计划社会发展项目（2015-S-141-19）

厦门大学附属福州第二医院麻醉科，福建 福州 350007