原发性闭角型青光眼动物模型研究进展

潘金花 赵瑛 相波 宋姗姗

·综述·

原发性闭角型青光眼动物模型研究进展

潘金花 赵瑛 相波 宋姗姗

青光眼是一组伴有特征性视神经损害和视野缺损的视神经病变,是世界上三大致盲性眼病之一。青光眼性失明,就目前医学治疗手段而言是无法使其逆转而恢复的。目前关于青光眼的发病机制还不清楚。但可以明确的是高眼压是造成青光眼的危险因素。因此在青光眼研究领域中,利用动物模型来研究青光眼的发病机制或治疗等已经成为必不可少的研究工具。本文主要概述了近些年来关于原发性角闭型青光眼高眼压动物模型的研究进展。

原发性闭角型青光眼; 动物模型; 综述

青光眼有很多种分类方法,可以根据病因学,解剖学和发病机制等分类,通常主要分为原原发性开角型青光眼(Primary Open Angle Glaucoma,POAG),原发性闭角型青光眼(Primary Angle Closure Glaucoma PACG),原发性先天性青光眼(Primary Congenital Glaucoma,PCG)等三大类。西方国家青光眼患病人数中POAG 和PCG 是最常见的类型[1],而亚洲地区主要是以开角型青光眼为主。Quigley[2]等根据世界各地以人群为基础的流行病学研究,用联合国2010年和2020年世界人口推算,2010年全球青光眼人数将达到6050万,而到2020年青光眼人数将增加到7960万。原发性闭角型青光眼主要分布于亚洲,尤其是我国最常见[3]。青光眼的发病机制目前主要有机械压力学说和血管缺血学说,目前青光眼的发病机制尚不清楚,但是高眼压是最主要的危险因素。因此利用动物模型来研究青光眼的发病机制及治疗是一个重要的手段。目前开角型青光眼造模运用的动物有小鼠,大鼠,兔。不同种属动物造的青光眼模型各有不同。以下分别对这几种动物模型分别介绍。

1 小鼠动物模型

1.1小鼠眼球与人眼的相似性

研究表明,小鼠的眼睛与其他的动物眼相比人的眼相比有很多的相似之处。其中包括眼的解剖结构,房水的生成过程[4],房水的外流途径[5],眼压的日周期变化[6],以及对降眼压药物的反应[7-10]等。Smith等研究结果显示:孕14.5天时小鼠虹膜角膜角开始形成,至生后42天才完全发育成熟。其形态生成的顺序与人眼相似,不同的是人眼发育的时间比鼠眼更长,出生后8年房角结构才完全发育成熟。在结构方面,小鼠亦有成熟的睫状体、小梁网、Sclllemm管、视网膜等。在房角的发育机制方面,小鼠亦与人类相似。Lindsey和Weinreb[11]用荧光标记的右旋糖酐证明了小鼠同时存在2种房水外流途径,而且以葡萄膜巩膜外流途径为主。前列腺素类药物能够降低人眼眼压,其机理是促进房水的葡萄膜巩膜外流。由于小鼠的房角结构以及房水循环途径与人的相似,因此这类药物也能够被运用来降低小鼠的眼压,此外是人和小鼠房角结构和房水循坏的相似性为研究新型降压药物提供了新的研究领域。

1.2小鼠青光眼动物模型的优缺点

小鼠房角的发育以及房水循环与人眼相似,小鼠青光眼造的动物模型更加接近人眼。同时小鼠性情较温和,体型小便于饲养和管理,对于实验室的要求不高。实验者在造模时操作方便,小鼠性成熟早,繁殖能力强因此可以根据实验需求提供大量的样本。此外小鼠价格便宜。这些因素都使得小鼠作为青光眼造模的常用动物。但是用小鼠作为青光眼动物模型的缺点是小鼠胆小,对环境的适应性低,不耐寒热,过冷过热均会造成死亡,不耐强光和噪声,对疾病抵抗力差。眼球小,测量眼压困难,筛板,视网膜中央动脉及静脉移位到视神经下方。

1.3小鼠急性高眼压的动物模型的造模方法

1.3.1转基因技术

近些年来一种新型的自发性急性高眼压转基因小鼠CLR(calcitonin receptor-like receptor)的发现[12]为急性闭角型青光眼的动物造模提供了新的途径。通过转基因技术将使瞳孔括约肌上 CLR /RAMP2 AM 受体过度表达导致AM介导的瞳孔括约肌的松弛,从而导致功能缺陷,使小鼠在出生后1～3月之内,会出现眼压急性、暂时性的升高,而对比在野生型小鼠中却没有出现眼压升高的情况[12]。

1.3.2激光光凝巩膜浅层静脉

C.T.Fu and D.Sretavan,R.L.Gross,J.Ji,P.Chang等[13-15]研究显示激光光凝小鼠巩膜浅层静脉4周内,眼内压会升高,同时还伴有视网膜神经节细胞的损失,视网膜神经节细胞轴突的损伤。

1.4小鼠慢性高眼压的动物模型的造模方法

1.4.1转基因技术

K.Fujikawa,T.Iwata,K.Inoue,[16]等利用转基因技术敲除小鼠的Vav2和Vav3,Vav2和Vav3的缺失会导致眼压的升高,最终形成青光眼。此外Vav2和Vav3丧失会引起虹膜角膜角的改变并最终导致慢性闭角型青光眼。

1.4.2激光光凝

2003年Aihara等[17]首次用二极管激光(波长532nm,能量200mW,间隔O.OSs,光斑200wm)照射小鼠的角膜缘,出现持续的眼压升高。他们用玻璃微管抽掉鼠眼的一部分房水使前房变浅后实施激光照射,并在前房插人玻璃微针测量术后12周内眼压的变化情况。在实验的22只NIH black Swiss小鼠中,15只术眼于术后1周、9只术眼于术后4周、5只术眼于术后12周眼压升高均超过30%。组织学分析显示激光光凝眼的房角闭合,未观察到Schlemm管,亦未发现角膜缘有炎性细胞。结果证明,此种二极管激光光凝引起小鼠眼压升高的方法是有效的,能在一次手术后即产生较高的成功率。然而,由于该法可能导致眼内炎症且眼压升高程度及持续时间变化较大,有一定的局限性。

1.4.3烧灼巩膜浅层静脉

Ruiz-Edrra和Verkman[18]模仿大鼠青光眼模型的制作方法,烧灼小鼠的三支巩膜上静脉,堵塞其房水外流途径而达到升高眼压的目的。由于小鼠眼球过小,该手术操作难度较大,易损伤巩膜及眼周组织,且可能引起眼内炎症,眼压升高并不明显,持续时间变异较大,因此这种技术尚待进一步研究。

2 大鼠动物模型

2.1大鼠眼球与人眼的相似性

大鼠眼与人眼相比有很多相似之处与前面所讲的小鼠类似。不同的是大鼠缺乏筛板,无黄斑,85%～90%视神经轴突会交叉到对侧大脑。这与人眼有差别,但在房水循环方面与人眼球近似。

2.2大鼠青光眼动物模型的优缺点

大鼠青光眼动物模型的优点是:基因组与人类有同源性;价格低,易饲养,数量多,个体小,易抓取、眼球,视神经及上丘皆可以在实验室中触及。其缺点即:缺乏筛板,无黄斑,85%-90%视神经轴突会交叉到对侧大脑。不利于进一步研究青光眼引起的视神经病变。因此会受到制约,但总体来讲以下几种实验模型是目前青光眼动物造模常选择的方式。

2.3大鼠急性高眼压的动物模型的造模方法

2.3.1眼外静脉结扎术

Yu S等[19]研究表明眼外巩膜静脉结扎,术后1天会眼压开始升高,可持续7个月的中度高眼压。同时实验结果还显示高眼压会导致视网膜神经节细胞的死亡及视神经的病变。

2.3.2前房灌注生理盐水

前房灌注生理盐水使眼压升高的机制是使视网膜缺血,导致视网膜电图(ERG)在短时间内迅速消失。罗学港等[20]选健康大鼠45只,戊巴比妥钠腹控注射麻醉。校正二道记录仪描笔至零位,将穿刺针水平刺入右眼前房,记下正常眼内压曲线(共测量27例,平均压力14,96mmHg,SD 2.72mmHg)。升压至60mmHg持续3小时,逐渐降压后拔出穿刺针。实验中,随着压力升高,伴有角膜混浊、瞳孔扩大等高眼压体征。高压眼视网膜神经节细胞细胞色素氧化酶活性明显下降。

2.4大鼠慢性高眼压的动物模型的造模方法

2.4.1巩膜表层静脉注射高渗盐水

啮齿类动物开创慢性高眼压模型始于1997年,Morrison[21]等通过巩膜表层静脉注射高渗盐水形成慢性高眼压模型。他们采用采用 Brown Norway 大鼠,将聚丙烯环置于眼球赤道部,暴露巩膜表面静脉,将微针头朝向角膜缘并与血管壁平行插入血管腔,并立即注射50μL 1.75 mol / L的高渗盐水,注射速度为2 500 n L / s。注射后7 ～ 10 d,小梁网坏死,房水外流途径受阻,引发眼压升高,并可一直持续200 d。前房角检查显示小梁网发生前粘连,但是 schlemm管、集合管、房水静脉都是开放的。

2.4.2前房注射透明质酸

Benozzi J[22]等通过单次注射注射 25μL 10mg /m L 的透明质酸入大鼠前房,可使大鼠实验眼眼压高于对照眼两倍,持续5d,形成急性高眼压模型。但如果每周重复注射一次,持续注射 9w,大鼠眼压可持续稳定升高达 10 w,形成慢性高眼压模型。

2.4.3烧灼巩膜浅层静脉

烧灼巩膜浅层静脉来提高眼压。最初由Shared[23]等提出,通过烧灼角巩膜缘2～3 mm范围内的2～3条巩膜浅层静脉而增加小梁网后阻力。。此方法诱导的高眼压水平与烧灼静脉条数大致呈正比[24]:l条时,眼压不升高;2条时,眼压升高至少1.5倍,维持数周;3条时,眼压升高1.9～2.3倍,维持4～10周;4条时,则眼球明湿突出致暴露性角膜病变,并使虹膜移位、前房变深。与激光及高渗盐水法相比,此方法技术要求略低,不涉及眼内操作,不引入外源性物质,诱导过程类似于继发性青光眼,高眼,维持时间长且稳定,可重复性,但在实际操作中,要求手术者能识别静脉解剖标志及其变异,且烧灼阻断眼的静脉引流系统,可引起视网膜的不同程度的损伤[24]。

3 兔闭角型青光眼动物模型

3.1兔眼与人眼的相似性

兔眼与人眼相似主要表现在解剖结构相似。兔眼有角膜但是角膜较人眼相比较薄、前房浅、晶状体相对大、更凸、玻璃体容积小、白兔眼底无色素、有黄斑区无黄斑中心凹、视网膜血管分布不同、有鞘神经纤维。

3.2兔青光眼动物模型的优缺点

兔作为青光眼动物模型的优点有:兔眼眼球体积大,兔眼球解剖结构与人相似。虹膜内有色素细胞,前房浅;性情温和,好饲养,眼球大便宜观察。同时其繁殖能力强,能够提供大样本。此外它的缺点为:兔眼硬度比人眼低很多,因为其巩膜壁很薄。所以对兔眼的处理一定要精细,研究者对眼球的一些消毒及机械损伤都很可能伤及研究所需观察的细胞或眼内结构。兔眼的视网膜色素上皮层同神经上皮层结合比人类的紧密。分离这两层常常要用酶消化。而人的可以机械分离。兔眼的大部分细胞都比较脆弱,不容易分离和培养,耐受性差。不像人眼细胞,还是很容易培养的。因为很少有针对兔子的抗体,选择兔子为实验动物,抗体很难买。

3.1兔急性高眼压动物模型造模方法

研究表明闭角型青光眼动物模型可以通过水负荷法[25-26]来提高眼压或氩激光光凝小梁网诱导形成急性高压[27-28]。Liu[29]等给禁饮食24h的清醒家兔以60ml/kg蒸馏水灌胃形成高眼压,升压过程约为2h,最高峰出现在30～45min,平均升高约100mm Hg,4小后逐渐恢复正常。李耐三等[30]认为该方法限用于雄性家兔,其实验采用2～3kg雄性兔,禁食12h后以30%乌拉坦作耳静脉全麻,用37℃自来水按100m Wkg灌胃形成高眼压。虽然这些动物模型IOP升高并形成青光眼但是这些模型仍有缺点。例如:在水负荷法模型中,它对整个眼睛都有损害以及眼内压升高持续时间不足1小时并最终导致RGCs选择性损失。

3.2兔慢性高眼压动物模型造模方法

3.2.1a糜蛋白酶方法

a糜蛋白酶方法造模的具体方法是:选择新西兰兔体重适宜,然后用戊巴比妥麻醉,用1ml注射器在兔兔的颞侧角膜缘穿孔,将浓度为2000U/ml的糜蛋白酶0.2ml经兔瞳孔注入到鼻侧后房。为了加深后房,术前用匹鲁卡品缩瞳。高眼压持续的时间可稳定持续两到三个月。该高眼压模型的兔眼压一般呈中度升高,一般在25～35mmHg之间。

3.2.2药物诱导法

常用药物诱导法有:结膜下注射倍他米松,地塞米松等皮质内固醇药物。皮质内固醇方法诱导青光眼的原理是;皮质类固醇诱导酸性黏多糖在前房角组织内异常聚积,造成房水流出过程受阻而导致眼压的升高。此外还有复方卡波姆法,是利用0.3%卡波姆和0.025%地塞米松混合在酸碱度为4的溶液中,注入眼前房,使房角流出的通道阻滞,诱导建立青光眼的动物模型。

3.2.3甲基纤维素法

甲基纤维素法是利用不溶的甲基纤维素形成凝胶沉积在前房,使房水无法外流,引发眼内压升高。林桂子[31]首先选取无眼部疾病的健康兔20只,随机分为4组(n=5),分别采用甲基纤维素M20、甲基纤维素M450、甲基纤维素MCH,在术后2h、4h、12h、24h、48h、96h、1192h和384h测定眼内压,在3d、6d、12d和18d时对角膜混浊度、血管新生情况进行评分;第18d对试验兔进行安乐死,摘取眼球进行病理组织学观察。结果提示甲基纤维素MCH建立的青光眼模型眼内压稳定,维持时间长,前房角组织结构病变符合青光眼病例的特征。

4 结语

青光眼的造模方法有许多种,各种青光眼动物模型各有各自的特点,同时也存在着许多不足。而本文主要是从高眼压这一角度去概述了近些年闭角型青光眼的动物造模方法,闭角型青光眼常用的造模动物包括了小鼠,大鼠,兔。啮齿类动物则以巩膜表面静脉注射高渗盐水,为公认的较为理性的慢性高眼压青光眼模型。随着科技的进步,近几年来基因技术的广泛运用,利用转基因小鼠来构造急性高眼压青光眼模型也越来越受到关注。随着人们对青光眼动物模型的不断探究和完善,将会为青光眼的治疗,预防带来新的研究方法。

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Advancesofanimalmodelsofprimaryangleclosureglaucoma

PAN Jin-hua,ZHAO Ying,XIANG Bo,SONG Shan-shan

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Glaucoma,a group of optic neuropathy with characteristic optic nerve damage and visual defect, is one of the three major blind eye diseases in the world.Glaucoma blindness can not be reversed by current medical treatments.The pathogenesis of glaucoma is not yet known.But it is clear that high intraocular pressure is a risk factor for glaucoma.Therefore,in the field of glaucoma study,the use of animal models to study the pathogenesis or treatment of glaucoma has become an essential research tool.This paper mainly summarizes the progress of the research on the model of primary Angle closed glaucoma in recent years.

Primary angle-closure glaucoma; Animal models; Reviewed

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.03.016

R775

610075,四川成都,成都中医药大学

赵瑛,E-mail:sczhaoying@sina.com