乳腺浸润性微乳头状癌组织β1 integrin及Rac1和RhoA表达的研究*

郑霞 刘冰冰 孟凡凡 李帅 谷峰 付丽

·临床研究与应用·

乳腺浸润性微乳头状癌组织β1 integrin及Rac1和RhoA表达的研究*

郑霞 刘冰冰 孟凡凡 李帅 谷峰 付丽

目的：探讨极性蛋白β1 integrin及Rac1和RhoA在乳腺浸润性微乳头状癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）组织中的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学法检测天津医科大学肿瘤医院自2007年1月至2008年12月89例乳腺IMPC患者组织中β1 integrin、Rac1及RhoA的表达，并选取该院同期诊断的90例乳腺浸润性导管癌非特殊型（invasive ductal carcinoma-not other⁃wise specified，IDC-NOS）病例作为对照，分析3种蛋白间及其与临床病理学特征之间的关系。结果：IMPC组织中β1 integrin及Rac1蛋白高表达率分别为78.7%（70/89）和76.4%（68/89），显著高于IDC-NOS组织的63.3%（57/90）和54.4%（49/90），差异均具有统计学意义（P＜0.05）；IMPC组织中RhoA阳性表达率为68.5%（61/89），显著高于IDC-NOS组织的44.4%（40/90），差异亦具有统计学意义（P=0.001）。IMPC组织中β1 integrin与Rac1表达均与淋巴结转移呈正相关（P＜0.05），且二者之间呈正相关（P=0.006）；RhoA表达与淋巴结转移、ER及PR呈正相关（P＜0.05），但与β1 integrin及Rac1的表达无显著相关性（P＞0.05）。结论：极性蛋白β1 integrin、Rac1及RhoA在乳腺IMPC组织中过表达，提示其可能均在IMPC的高转移中发挥重要作用，且可能成为靶向治疗研究的新靶点。

乳腺浸润性微乳头状癌 转移 β1 integrin Rac1 RhoA

乳腺浸润性微乳头状癌（invasive micropapillary carcinoma，IMPC）是一种具有高转移性的特殊类型乳腺癌，其形态学表现为IMPC细胞呈集团性、极性倒转的微乳头和（或）微腺管状结构排列。研究发现IMPC细胞的极性倒转可能与其高转移特性密切相关［1］，从极性方面入手进行研究及探讨导致IMPC高转移的原因是解析IMPC高侵袭、高转移的关键，具有极其重要的意义。β1 integrin、Rac1和RhoA均是与极性相关的蛋白分子［2-3］，且三者均在恶性肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用［4-6］。本研究旨在探讨β1 integrin、Rac1和RhoA与IMPC高转移的关系，并结合IMPC患者的临床病理学特征分析其相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

收集天津医科大学肿瘤医院2007年1月至2008年12月89例乳腺IMPC患者的组织为研究组，随机选取同期90例乳腺IDC-NOS患者的组织作为对照组。所有患者均为女性，均行改良根治术治疗，术前均未行放疗或化疗。IMPC组患者年龄为28～80岁，中位年龄为51岁；IDC-NOS组患者年龄为30～89岁，中位年龄为55岁。本研究获得天津医科大学肿瘤医院伦理委员会认可，且患者均签署知情同意书。1.2方法

1.2.1 免疫组织化学方法标本均经10%中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，4 μm切片处理，柠檬酸盐缓冲液抗原修复，常规免疫组织化学SP法检测极性蛋白β1 integrin、Rac1和RhoA。SP-9000、DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司；所有一抗包括兔抗人β1 integrin单抗、鼠抗人Rac1单抗、鼠抗人RhoA单抗均购自美国Abcam公司。实验过程严格按照试剂盒的说明书进行操作，DAB显色，苏木精复染，透明封固。已知阳性乳腺癌切片为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 IMPC的组织学分级标准根据改良后的Bloom-Richardson分级系统［7］分为以下三级：Ⅰ级：癌细胞胞核大小、形状及染色质基本一致或轻度异型，无或偶见核分裂像1个/10HPF；Ⅱ级：癌细胞核大小、形状及染色质中度异型，可见核分裂像2～3个/10HPF；Ⅲ级：癌细胞核大小、形状及染色质重度异型，核分裂像＞3个/10HPF。

1.2.3 结果判定β1 integrin主要定位于细胞膜和（或）细胞质中，Rac1主要定位于细胞核和（或）细胞质中，二者切片中阳性细胞百分比≤1分为低表达，阳性细胞百分比≥2分为高表达［8-9］。RhoA主要定位于细胞质中，判定标准参照Allred评分系统［10］；ER、PR及HER-2的判定标准参照美国临床肿瘤学会与美国病理医师学会指南［11］。

1.3 统计学分析

所有数据均采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。分类资料组间比较采用χ2检验，两变量相关性采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IMPC的形态特征

IMPC形态学表现为癌细胞排列呈不含纤维脉管束的微小乳头状或小腺管状结构，镜下可见微乳头或腺管状结构呈现一种主、间质分离的现象（图1A）；上皮膜抗原（EMA）免疫组织化学染色时发现微乳头状结构的外表面呈现阳性（图1B）。

图1 IMPC及IDC-NOS的形态特征（边角×200）Figure 1Histological features of IMPC and IDC‐NOS(inset×200)

2.2 临床病理学特征

乳腺IMPC及IDC-NOS组患者的临床病理学特征分析结果表明，相较IDC-NOS组乳腺IMPC组患者具有更高的淋巴结转移率（P＜0.001），而两组患者的年龄、肿瘤大小、组织学分级、ER、PR及HER-2比较均差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.3 β1 integrin、Rac1、RhoA的表达及与IMPC患者临床病理学特征的相关性

2.3.1 β1 integrin、Rac1及RhoA在IMPC组及IDCNOS对照组中的表达β1 integrin、Rac1及RhoA蛋白在IMPC组及IDC-NOS对照组中的表达特点见图2。IMPC组中β1 integrin及Rac1蛋白高表达率分别为78.7%（70/89）及76.4%（68/89），显著高于IDC-NOS组中的63.3%（57/90）及54.4%（49/90），差异均具有统计学意义（P＜0.05）；IMPC组RhoA阳性表达率为68.5%（61/89），显著高于IDC-NOS组的44.4%（40/90），差异亦具有统计学意义（P=0.001，表2）。

表1 IMPC与IDC-NOS组患者的临床病理学特征比较Table 1Clinicopathological parameters of patients with IMPC or IDC‐NOS

图2 β1 integrin、Rac1及RhoA在IMPC组与IDC-NOS组中的表达（SP×100，边角×200）Figure 2Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in patients with IMPC and IDC‐NOS(SP×100,inset×200)

表2 β1 integrin、Rac1及RhoA在IMPC组及IDC-NOS组中的表达Table 2Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in patients with IM‐PC and IDC‐NOS

2.3.2 β1 integrin、Rac1、RhoA的表达与IMPC临床病理学特征的相关性Spearman等级相关分析显示，IMPC组织中β1 integrin与Rac1表达均与淋巴结转移呈正相关（P＜0.05），且二者之间呈正相关（P=0.006，表3）；而RhoA表达除与淋巴结转移呈正相关（P＜0.001），也与ER及PR呈正相关（P＜0.05），但与β1 integrin及Rac1的表达无显著相关性（P＞0.05）。β1 integrin、Rac1及RhoA的表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、HER-2的表达均无显著相关性（表4）。

表389 例IMPC患者中β1 integrin及Rac1蛋白表达的相关性Table3Correlationbetweenβ1integrinandRac1in89patientswithIMPC

表489 例IMPC患者中β1 integrin，Rac1及RhoA的表达与临床病理学特征的相关性Table 4Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA and its correlation with clinicopathologic factors in 89 patients with IMPC

3 讨论

细胞极性为多种不同类型细胞的共同特征，是指膜蛋白及细胞器沿顶点端-基底端轴的不对称分布。细胞极性在多数细胞的分化和发挥功能方面起到关键性作用，如乳腺正常腺管细胞的极性，可维持顶点端位于管腔侧，基底端位于基底侧，这种极性的不对称分布可以确保乳汁的正常分泌。在乳腺IMPC中，乳腺上皮的顶点端朝向基底侧，基底端朝向管腔侧，顶点端-基底端轴发生极性倒转导致细胞无法发挥其正常功能。Chen等［1］发现即使在含有极少IMPC成分的IDC-NOS中，其淋巴结转移也明显高于未含有IMPC成分的IDC-NOS，并且转移病灶的肿瘤成分大多为IMPC，提示IMPC的高转移特性可能与其癌细胞的极性倒转密切相关。

Has等［2］指出，整合素家族的亚单位β1 integrin能够与其配体如kindlin-1、α-actin等结合并激活其下游的Rac1及RhoA，并通过众多的效应物来建立以及维持上皮细胞的极性。并且研究发现β1 integrin、Rac1及RhoA均在促进乳腺癌的发生及发展过程中发挥重要作用［4，6］。本研究发现，乳腺IMPC组织中β1 integrin、Rac1及RhoA蛋白表达均明显高于对照组IDC-NOS，差异具有统计学意义，提示极性蛋白β1 integrin、Rac1及RhoA过表达可能在IMPC的恶性进展中发挥一定的作用。同时在对β1 integrin、Rac1及RhoA蛋白表达及IMPC临床病理学特征的相关性分析发现，3种蛋白的表达均与淋巴结转移呈正相关，提示三者可能在IMPC高转移过程中扮演了重要角色。

Wang等［12］在研究中发现，Oridonin蛋白可通过抑制β1 integrin/FAK通路阻断MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭。此外，研究还发现β1 integrin是Twist介导的EMT过程的主要调节蛋白，Twist-β1 integrin-FAK/ILK通路可以促进乳腺癌细胞的浸润以及转移［13］。本研究通过对β1 integrin表达水平与临床病理学特征之间的相关性进行分析显示，在IMPC组中β1 integrin表达水平与淋巴结转移呈正相关，与Yen等［14］的研究结果相符。

癌细胞的浸润和转移是一个多步骤、多环节复杂的生物学过程，癌细胞的迁移性运动在此过程中发挥了重要作用。Rac1和RhoA可通过参与片状伪足的形成及黏着斑的改变并以此介导癌细胞的迁移性运动，以进一步促进癌细胞的浸润及远处转移。Huang等［5］在胃癌的研究中发现，高表达量的RhoA更易参与弥漫性胃癌的肝转移过程。Rozenchan等［6］的研究也发现，在乳腺癌细胞以及转移的淋巴结中同样存在高表达量的Rac1以及RhoA。本研究结果同样显示，在IMPC组织中Rac1及RhoA蛋白的表达水平与淋巴结转移呈正相关。因此，本研究结果提示，β1 integrin、Rac1及RhoA均可能在IMPC高转移的恶性生物学行为中发挥重要作用。

Liu等［15］在体内以及体外研究中发现，β1 integrin表达量降低的成纤维细胞中均伴随着Rac1的下降。在一项关于β1 integrin/kindlin-1通路的研究中，Has等［2］发现Rac1的激活受β1 integrin的下游分子kind⁃lin-1的控制。Bulanova等［16］在敲除G蛋白耦合受体C类5组（G protein coupled receptor class C group 5，GPRC5A）之后发现，β1 integrin蛋白表达量的降低同样伴随着Rac1蛋白激活量的减少。本研究结果同样发现，在乳腺IMPC组织中β1 integrin的表达与Rac1的表达呈正相关，且二者均与淋巴结转移呈正相关，提示二者的协同作用可能在IMPC极性倒转结构的形成中发挥重要作用。

综上所述，本研究结果证明高表达的极性蛋白β1 integrin及Rac1和RhoA，尤其是β1 integrin及Rac1可能是导致乳腺IMPC高转移特性的重要原因。评估3种蛋白的表达情况可为临床治疗方案的选择及预后评估提供重要依据，而对其机制的深入研究将会对IMPC高转移机制有所解析，且将为其精准靶向治疗研究提供重要的理论依据。

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（2017‐03‐31收稿）

（2017‐06‐19修回）

郑霞专业方向为乳腺癌侵袭转移相关机制的研究。

E-mail：13512946090@163.com

·读者·作者·编者·

致谢审稿专家

《中国肿瘤临床》秉承“引导创新、关注前沿、突出临床、讲求实用”的办刊宗旨，以为读者提供高质量的学术内容为己任，邀请肿瘤学学科带头人及优秀学者作为审稿专家对每篇稿件进行把关与指导。在此，《中国肿瘤临床》编辑部全体人员对承担本期文章审稿工作的专家致以诚挚感谢，其公平、客观、准确、详实的审稿意见使文章质量得到了有效提高。专家名单列示如下（按姓氏笔画顺序）：

巴一教授天津医科大学附属肿瘤医院

申文江教授北京大学第一医院

刘伦旭教授四川大学华西医院

刘晓晴主任医师军事医学科学院附属医院

劳向明副教授中山大学肿瘤防治中心

张春霆副教授浙江大学金华医院

李忠武副教授北京大学肿瘤医院

李秋教授四川大学华西医院

杨吉龙教授天津医科大学附属肿瘤医院

姜战武主任医师保定市第一中心医院

柳剑英副教授北京大学医学部

贺慧颖副教授北京大学医学部

梅开勇教授广州医科大学附属第二医院

Expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in invasive micropapillary breast carcinoma

Xia ZHENG,Bingbing LIU,Fanfan MENG,Shuai LI,Feng GU,Li FU

Li FU;E‐mail:fulijyb@hotmail.com
Department of Breast Cancer Pathology and Research Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital;National Clinical Research Center for Cancer;Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin;Tianjin's Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Ministry of Education,Tianjin 300060,China

Objective:To investigate the expression and significance of β1 integrin,Rac1,and RhoAin invasive micropapillary breast carcinoma(IMPC).Methods:Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA in 89 patients with IMPC and 90 patients with invasive ductal carcinoma‐not otherwise specified(IDC‐NOS)who were treated between January 2007 and December 2008 in Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital.The relationship among the three proteins and the expression of β1 integrin,Rac1,and RhoA with clinicopathological features were determined.Results:β1 integrin(78.7%)and Rac1(76.4%)were highly expressed in patients with IMPC.This expression was significantly higher than that in patients with IDC‐NOS(63.3%and 54.4%).Statistical difference was found between the two groups(P＜0.05).Positive rate of RhoA(68.5%)in patients with IMPC was also statistically higher than that in patients with IDC‐NOS(44.4%,P=0.001).In patients with IMPC,the expression of β1 integrin and Rac1 was positively associated withlymphnodemetastasis(P＜0.05),whiletheexpressionof β1integrinwas positively correlatedwithRac1expression(P=0.006).Expression of RhoA was positively correlated with lymph node involvement and ER and PR status(P＜0.05).However,no correlation was found between RhoA expression and the expression of β1 integrin and Rac1(P＞0.05).Conclusion:Thus,β1 integrin,Rac1,and RhoA were overexpressed and might play an important role in the high frequency of metastasis in patients with IMPC.These proteins could be considered as biomarkers for the prognosis and new targets for IMPC therapy.

invasive micropapillary carcinoma,metastasis,β1 integrin,Rac1,RhoA

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.14.356

天津医科大学肿瘤医院乳腺病理研究室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室（天津市300060）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81672637）资助

付丽fulijyb@hotmail.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672637)