ERK5和MMP-9在骨肉瘤中的表达及其临床意义*

王建澍移志刚蒲彦川宋建民耿彬康雅琼马淑萍安丽萍夏亚一

·临床研究与应用·

ERK5和MMP-9在骨肉瘤中的表达及其临床意义*

王建澍①②③移志刚①②蒲彦川①②宋建民③耿彬①②康雅琼③马淑萍③安丽萍②夏亚一①②

目的：探讨细胞外信号调节激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）蛋白和基质金属蛋白酶-9（matrix metallo proteinase-9，MMP-9）在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义。方法：选取71例骨肉瘤组织和40例正常骨组织，采用免疫组织化学法检测ERK5和MMP-9的表达，并分析ERK5和MMP-9的表达与骨肉瘤患者临床病理特征及预后之间的关系。结果：骨肉瘤组织中ERK5和MMP-9阳性表达率分别为85.9%（61/71）、74.65%（53/71），均明显高于正常骨组织中阳性表达率12.5%（5/40）、10.0%（4/40），差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。ERK5和MMP-9的阳性表达与Enneking分期和转移相关（均P＜0.05）。Ka⁃plan-Meier生存分析显示在骨肉瘤组织中ERK5、MMP-9的阳性表达组患者生存时间均短于阴性表达组（均P＜0.05）。单因素Cox回归分析发现，肿瘤大小、Enneking分期、转移、ERK5和MMP-9阳性表达与患者总生存时间相关（均P＜0.05）；多因素分析证实Enneking分期、转移、ERK5和MMP-9蛋白的阳性表达可作为骨肉瘤患者独立的预后因子（均P＜0.05）。结论：ERK5和MMP-9在骨肉瘤组织中高表达，与骨肉瘤的病理特征及预后相关；二者可能在骨肉瘤发生发展的过程中起着重要作用。

骨肉瘤 细胞外信号调节激酶5 基质金属蛋白酶-9 免疫组织化学 预后

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，大部分起源于长骨的干骺端，以儿童和青少年发病最多见［1］。其恶性程度高，早期易发生肺转移，死亡率高，预后差。随着外科技术的发展和辅助化疗的广泛应用，患者5年生存率提高到60%～80%［2］。但有部分患者局部仍易复发导致截肢，少部分患者因远处转移而死亡。因此，探讨骨肉瘤发生侵袭及转移的相关机制，寻找能够早期诊断或评估骨肉瘤侵袭性及远处转移的标记物或治疗靶点对骨肉瘤的综合治疗至关重要。作为广泛存在于哺乳动物细胞内的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族是一类介导细胞反应的重要信号系统，通过将胞外的刺激信号传递至胞核内，参与细胞的增殖、分化等功能［3］。细胞外信号调节激酶5（extra⁃cellular signal-regulated kinase 5，ERK5）是MAPK家族发现较晚的转导体，其可以被许多胞外刺激因素激活，包括氧化应激反应、高渗压、流体切应力、表皮生长因子等，诱导细胞发生相应生物学特性变化，参与机体多种生理病理过程，如脑发育、肾病、癌症及糖尿病等［4-5］。最近研究表明，ERK5可促进肿瘤血管的生成并对肿瘤细胞生长起重要作用［6-7］。目前已经证实ERK5在前列腺癌［8］、白血病［9］、乳腺癌［10］、恶性间皮瘤［11］等多种肿瘤中高表达，且参与肿瘤发生发展。然而关于ERK5在骨肉瘤中的表达及其与MMP-9的相互关系尚缺乏相关报道，本研究通过免疫组织化学法检测ERK5和MMP-9在骨肉瘤组织中表达情况，分析其与骨肉瘤患者临床病理特征及预后的相关性，以期为早期诊断及分子靶向治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料收集甘肃省肿瘤医院2011年4月至2016年6月收治的术前穿刺活检和切开活检的71例骨肉瘤患者的组织标本，所有标本经病理学确诊，活检前均未行术前放化疗。其中男性48例，女性23例，年龄为6～65岁，平均年龄18岁。分期按骨与软组织肿瘤外科分期系统即Enneking分期，ⅡA期21例，ⅡB期14例，Ⅲ期36例；成骨细胞型34例，成软骨细胞型13例，成纤维细胞型12例，混合型12例；远处转移43例。另取40例正常骨组织作为对照。所有病例、临床资料完整，同时排除糖尿病、肾病等其他代谢性疾病的患者。对71例骨肉瘤患者以手术日期为随访起点，采用电话、门诊的方式进行随访，截止时间为2016年12月30日，随访时间为6～69个月，平均随访时间为23个月。本研究获得患者的知情同意及甘肃省肿瘤医院伦理委员会的批准。

1.1.2 主要试剂兔抗人ERK5多克隆抗体（BS6705）购自美国Bioworld Technology公司，兔抗人MMP-9多克隆抗体（ab38898）购自英国Abcam公司。免疫组织化学SP试剂盒（SP-9001）及DAB显色试剂盒、小鼠抗人βactin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或抗小鼠IgG（二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测用自动组织切片机对常规石蜡包埋组织标本进行4 μm厚度的连续切片，严格按照试剂盒说明书进行免疫组织化学染色。具体为常规脱水、透明、水化切片；浸在pH为6.0的柠檬酸钠溶液中微波抗原修复，于3%H2O2中消除内源性过氧化物酶活性；滴加兔抗人ERK5多克隆抗体（体积稀释比例为1:200）、兔抗人MMP-9多克隆抗体（体积稀释比例为1:150），放置在湿盒中4℃反应过夜；滴加生物素标记的二抗工作液，37℃反应15 min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃反应15 min；加DAB显色液显色5 min；苏木精对比染色，梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。用已知阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.2.2 ERK5蛋白阳性表达的结果判定主要定位于细胞质和（或）细胞核；MMP-9蛋白阳性表达主要定位于细胞质，二者均呈现棕黄色颗粒。每张切片高倍镜下（×200）选取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，按染色强度及阳性细胞比例积分，结果判读采用半定量积分分级，积分=染色强度×染色细胞比例。染色强度：无着色为0，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色细胞比例：阳性细胞＜5%为0，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两者相乘为总的分数，＞4分为阳性表达，≤4分阴性表达。以上结果均至少由两位病理科医生以盲法观察确定。1.3统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关系数检验；采用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线，并进行Log rank检验；采用Cox回归法进行单因素和多因素的生存分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ERK5、MMP-9在骨肉瘤和正常骨组织中的表达

免疫组织化学法检测结果显示，ERK5蛋白表达主要定位于细胞质和（或）细胞核，MMP-9蛋白表达主要定位于细胞质（图1）。71例骨肉瘤组织中ERK5、MMP-9的阳性表达率为85.9%（61/71）、74.65%（53/71），均明显高于正常骨组织中阳性表达率12.5%（5/40）、10.0%（4/40），差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。釆用Spearman相关性分析发现，ERK5与MMP-9表达呈正相关（r=0.934，P＜0.01）。

2.2 ERK5、MMP-9在骨肉瘤组织中的表达与临床病理参数的相关性分析

在71例骨肉瘤组织中ERK5和MMP-9阳性表达与Enneking分期、转移期相关（均P＜0.05）。在En⁃neking分期为ⅡB/Ⅲ期的骨肉瘤组织中二者的阳性表达高于ⅡA期，差异具有统计学意义（P＜0.05）。43例发生转移的骨肉瘤患者中，42例（97.7%）ERK5呈阳性表达，40例（93.0%）MMP-9呈阳性表达；而在28例未发生远处转移的骨肉瘤标本中，19例（67.9%）ERK5呈阳性表达，13例（46.4%）MMP-9呈阳性表达，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。而与其他临床病理特征如年龄、性别、肿瘤部位、肿块大小、组织学分型均无关（均P＞0.05，表1）。

2.3 ERK5和MMP-9阳性表达与骨肉瘤患者预后关系

71例骨肉瘤患者中，36例患者死亡，总生存率为49.3%。ERK5阳性表达患者的中位生存时间为15个月，阴性表达患者的中位生存时间为30个月。Ka⁃plan-Meier生存分析结果显示，在骨肉瘤组织中阳性ERK5表达的患者组生存时间明显短于阴性表达ERKS的患者组，差异具有统计学意义（χ2=8.102，P＜0.01）。MMP-9阳性表达患者的中位生存时间为18个月，阴性表达患者的中位生存时间为36个月。Ka⁃plan-Meier生存分析结果显示，在骨肉瘤组织中阳性表达MMP-9的患者生存时间明显短于阴性表达ERK5的患者，差异有统计学意义（χ2=7.954，P＜0.01，图2）。单因素分析显示，肿瘤大小、Enneking分期、转移、ERK5和MMP-9阳性表达与患者总生存时间相关（均P＜0.05）。多因素Cox生存分析发现Enneking分期、转移、ERK5蛋白和MMP-9蛋白的阳性表达可作为骨肉瘤患者独立的预后因子（均P＜0.05，表2）。

图1 免疫组织化学法检测骨肉瘤和正常骨组织中ERK5、MMP-9的表达（DAB×200）Figure1Immunohistochemical analysis of ERK5 and MMP‐9 protein expression levels(DAB staining,×200)in osteosarcoma and normal bone tis‐sues.ERK5 expression is localized within the cytoplasm and nucleus

表1 ERK5和MMP-9在骨肉瘤组织中的表达与临床病理参数的相关性分析Table 1Relationship between ERK5 and MMP‐9 expression levels in osteosarcoma tissues and clinicopathologic characteristics

表1 ERK5和MMP-9在骨肉瘤组织中的表达与临床病理参数的相关性分析（续表1）Table 1Relationship between ERK5 and MMP‐9 expression levels in osteosarcoma tissues and clinicopathologic characteristics

图2 骨肉瘤患者的Kaplan-Merier生存曲线Figure 2Kaplan‐Meier curves of patients with osteosarcoma(n=71)

表271 例骨肉瘤患者总体生存率相关因素的单因素及多因素分析Table 2Univariate and multivariate analysis of factors related to overall survival(OS)in 71 patients with osteosarcoma

3 讨论

骨肉瘤是高度恶性的间叶组织肿瘤，年发病率约为3/100万［12］。由于骨肉瘤局部侵袭性生长并易发生远处转移，二十世纪七十年代以前，采用截肢为主的治疗手段并未改善患者的生存率，大部分患者于2年内死于肺转移［13］。虽然此后辅助化疗的广泛应用使患者肺转移率有所降低，但仍有20%患者在初次就诊时已发生肺转移；同时约80%患者在病程发展中也会出现肺转移［14-15］。近年来，国内外多中心研究机构进行了大量的努力，但全球骨肉瘤患者总体5年生存率仍无较大变化［16］。因此，寻找能够早期诊断发生转移的标记物对评估和改善患者预后显得尤为重要。

ERK5是MAPK家族成员之一，由816个氨基酸构成，其N末端包含有蛋白激酶区，C末端拥有独特的COOH；由于其C末端包含有400个氨基酸的扩展，长度几乎是其他MAPK家族成员的2倍。Buschbeck等［17］研究认为，ERK5几乎在所有的细胞中都有表达。ERK5可接受细胞外传来的信号并由其上游激酶MEK5激活，然后可转位于细胞核，对转录因子肌细胞增强子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）磷酸化而调节其转录活性。ERK5还可以入核调节其他转录因子的表达，如c-Jun、c-Fos等，参与细胞周期的调控、介导抗凋亡作用［18］。近年来研究发现，ERK5在肿瘤侵袭和转移等生物学过程中起传递和放大信号的作用。Mehta等［19］研究提出前列腺癌细胞中ERK5上游激酶MEK5的表达可增加MMP-9表达，导致前列腺细胞侵袭能力增强。Ramsay等［20］最新研究证实，在转移性前列腺癌细胞核中ERK5的表达较良性前列腺增生、原发性前列腺癌显著增高。Castro等［21］研究发现，在乳腺癌中ERK5可介导乳腺肿瘤激酶（breast tumor kinase，BRK）激活，从而导致肿瘤细胞发生侵袭和迁移。Sticht等［22］研究发现，磷酸化ERK5的阳性表达与口腔鳞状细胞癌的进展以及淋巴结的转移密切相关。以上研究提示ERK5蛋白可能和肿瘤的侵袭、转移有关。

本研究通过免疫组织化学方法检测71例骨肉瘤组织和40例正常骨组织中ERK5的表达，结果发现ERK5和MMP-9在骨肉瘤组织中表达明显高于正常骨组织。此外，ERK5和MMP-9的阳性表达均与骨肉瘤患者Enneking分期、转移相关。随着Enneking分期的增高，二者的阳性表达率逐步增高，与未发生远处转移患者相比，发生远处转移患者ERK5和MMP-9阳性表达率较高。提示ERK5可能介导骨肉瘤细胞侵袭临近组织，导致恶性程度增高，进而促进MMP-9的表达，最终发生肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移。Yue等［23］研究发现，沉默ERK5基因，骨肉瘤中MMP-9明显减少，侵袭性降低。基质金属蛋白酶系（MMPs）可通过对细胞外基质（ECM）和基底膜中不同成分的降解、破坏，使肿瘤细胞进入到循环系统并逃避宿主免疫系统，最终向肺等靶器官侵袭转移，形成转移病灶。Huang等［24］实验证实，高表达MAPK7和ERK5能促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及迁移。本研究Kaplan-Meier生存分析显示，ERK5和MMP-9阳性表达组患者生存时间明显低于阴性表达组；单因素和多因素Cox回归分析显示，ERK5和MMP-9蛋白的阳性表达可作为骨肉瘤患者独立预后的危险因素。以上结果表明，ERK5和MMP-9可能在骨肉瘤的发生发展过程中扮演了重要的角色，二者可能起协调作用，且与患者的预后密切相关。这些与前列腺癌、乳腺癌、口腔鳞癌等肿瘤的研究结果一致。

在骨肉瘤的早期诊治过程中，如何有效地降低和控制肺转移率，提高患者的长期生存率，是目前骨肉瘤治疗中瓶颈所在。除了规范的临床分期外，如何在早期就能够判断骨肉瘤患者的预后，找到监测骨肉瘤患者术后复发及转移的敏感标记物是临床上亟需解决的问题。在骨肉瘤患者中，阳性表达ERK5的患者可能需要更多的辅助性治疗和更加紧密的随访。EKR5作为MAPK家族中的新成员，在骨肉瘤形成、发展、转移等机制方面具有重要的意义和潜在的研究价值。本研究中，71例骨肉瘤患者病例资料收集时间跨度较长，可能因治疗水平的进展及患者治疗的依从性产生生存偏倚，带来相应统计学上的误差。因此，有必要在今后开展多中心、大样本、长时间随访来进行深入的研究，以期为骨肉瘤诊治、评估预后提供新的靶点。

[1]Li N,Luo D,Hu X,et al.RUNX2 and Osteosarcoma[J].Anticancer Agents Med Chem,2015,15(7):881‐887.

[2]Bacci G,Longhi A,Fagioli F,et al.Adjuvant and neoadjuvant chemo‐therapy for osteosarcoma of the extremities:27 year experience at Rizzoli Institute,Italy[J].Eur J Cancer,2005,41(18):2836‐2845.

[3]Ye M,Luo X,Li L,et al.Grifolin,a potential antitumor natural prod‐uct from the mushroom Albatrellus confluens,induces cell‐cycle ar‐rest in G1 phase via the ERK1/2 pathway[J].Cancer Lett,2007,258(2):199‐207.

[4]Abe J,Kusuhara M,Ulevitch RJ,et al.Big mitogen‐activated protein kinase 1(BMK1)is a redox‐sensitive kinase[J].J Biol Chem,1996,271(28):16586‐16590.

[5]Kamakura S,Moriguchi T,Nishida E.Activation of the protein kinase ERK5/BMK1 by receptor tyrosine kinases.Identification and charac‐terization of a signaling pathway to the nucleus[J].J Biol Chem,1999,274(37):26563‐26571.

[6]Hayashi M,Kim SW,Imanaka‐Yoshida K,et al.Targeted deletion of BMK1/ERK5 in adult mice perturbs vascular integrity and leads to endothelial failure[J].J Clin Invest,2004,113(8):1138‐1148.

[7]Hayashi M,Fearns C,Eliceiri B,et al.Big mitogen‐activated protein kinase 1/extracellular signal‐regulated kinase 5 signaling pathway is essential for tumor‐associated angiogenesis[J].Cancer Res,2005,65(17):7699‐7706.

[8]McCracken SR,Ramsay A,Heer R,et al.Aberrant expression of ex‐tracellular signal‐regulated kinase 5 in human prostate cancer[J].Oncogene,2008,27(21):2978‐2988.

[9]Lochhead PA,Gilley R,Cook SJ.ERK5 and its role in tumour devel‐opment[J].Biochem Soc Trans,2012,40(1):251‐256.

[10]Montero JC,Ocaña A,Abad M,et al.Expression of Erk5 in early stage breast cancer and association with disease free survival iden‐tifies this kinase as a potential therapeutic target[J].PLoS One,2009,4(5):5565.

[11]Ramos‐Nino ME,Blumen SR,Sabo‐Attwood T,et al.HGF mediates cell proliferation of human mesothelioma cells through a PI3K/MEK5/Fra‐1 pathway[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2008,38(2):209‐217.

[12]Picci P.Osteosarcoma(osteogenic sarcoma)[J].Orphanet J Rare Dis,2007,2(1):6‐15.

[13]Bramwell VH.The role of chemotherapy in osteogenic sarcoma[J].Crit Rev Oncol Hematol,1995,20(2):61‐85.

[14]Bhattasali O,Vo AT,Roth M,et al.Variability in the reported man‐agement of pulmonary metastases in osteosarcoma[J].Cancer Med,2015,4(4):523‐531.

[15]Hayden JB,Hoang BH.Osteosarcoma:basic science and clinical im‐plications[J].Orthop Clin North Am,2006,37(1):1‐7.

[16]Chou AJ,Geller DS,Gorlick R.Therapy for osteosarcoma:where do we go from here[J]?Paediatr Drugs,2008,10(5):315‐327.

[17]Buschbeck M,Ullrich A.The unique C‐terminal tail of the mitogen‐activated protein kinase ERK5 regulates its activation and nuclear shuttling[J].J Biol Chem,2005,280(4):2659‐2667.

[18]Nishimoto S,Nishida E.MAPK signalling:ERK5 versus ERK1/2[J].EM‐BO Rep,2006,7(8):782‐786.

[19]Mehta PB,Jenkins BL,McCarthy L,et al.MEK5 overexpression is as‐sociated with metastatic prostate cancer,and stimulates proliferation,MMP‐9 expression and invasion[J].Oncogene,2003,22(9):1381‐1389.[20]Ramsay AK,McCracken SR,Soofi M,et al.ERK5 signalling in prostate cancer promotes an invasive phenotype[J].Br J Cancer,2011,104(4):664‐671.

[21]Castro NE,Lange CA.Breast tumor kinase and extracellular signal‐regulated kinase 5 mediate Met receptor signaling to cell migra‐tion in breast cancer cells[J].Breast Cancer Res,2010,12(4):60.

[22]Sticht C,Freier K,Knöpfle K,et al.Activation of MAP kinase signal‐ing through ERK5 but not ERK1 expression is associated with lymph node metastases in oral squamous cell carcinoma(OSCC)[J].Neo‐plasia,2008,10(5):462‐470.

[23]Yue B,Ren QX,Su T,et al.ERK5 silencing inhibits invasion of human osteosarcoma cell via modulating the Slug/MMP‐9 pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(18):2640‐2647.

[24]Huang Y,Yao J,Zhu B,et al.Mitogen‐activated protein kinase 7 pro‐motes cell proliferation,migration and invasion in SOSP‐M human osteosarcoma cell line[J].Tumori,2015.[Epub ahead of print]

（2017‐02‐10收稿）

（2017‐06‐10修回）

（编辑：杨红欣校对：武斌）

王建澍专业方向为骨与软组织肿瘤的临床诊治。

E-mail：455841831@qq.com

·读者·作者·编者·

《中国肿瘤临床》文章荐读：乳腺癌新辅助化疗再认识

近年来随着乳腺癌新辅助化疗研究的深入，该治疗手段已在临床广泛应用。新辅助化疗使不可手术的局部晚期乳腺癌患者获得手术治疗的机会，并且提高具有较大肿瘤体积患者的保乳率，从而明显改善患者的生存质量，但仍有许多问题存在争议。《中国肿瘤临床》2016年第15期“特约综述”栏目中，特邀军事医学科学院附属医院乳腺外科主任黄焰教授对乳腺癌新辅助化疗相关临床研究进行综述，并分享其经验与观点。

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——本刊编辑部

ERK5 and MMP-9 expression levels in osteosarcoma and their clinical significance

Jianshu WANG1,2,3,Zhigang YI1,2,Yanchuan PU1,2,Jianmin SONG3,Bin GENG1,2,Yaqiong KANG3,Shuping MA3,Liping WANG2,Yayi XIA1,2

Yayi XIA;E‐mail:xiayayi@126.com
1Department of Orthopaedics,Second Hospital of Lanzhou University,Lanzhou 730030,China;2Orthopaedics Key Laboratory of Gansu Province,Lanzhou 730030,China;3Cancer Hospital of Gansu,Lanzhou 730050,China

Objective:To investigate the extracellular signal‐regulated kinase 5(ERK5)and matrix metallo proteinase‐9(MMP‐9)expres‐sion levels in osteosarcoma tissues and their clinical significance.Methods:The ERK5 and MMP‐9 expression levels in 71 specimens of osteosarcoma tissue and 40 specimens of normal bone tissue were detected by immunohistochemistry.The relationship between ERK5 and MMP‐9 expression levels,their clinical characteristics,and prognosis of patients with osteosarcoma were analyzed.Results:The positive expression of ERK5 and MMP‐9 in osteosarcoma tissues was 85.9%(61/71)and 74.65%(53/71),respectively,which were significantly higher than those in normal bone tissues at 12.5%(5/40)and 10.0%(4/40)(all P＜0.05).The positive expression of ERK5 and MMP‐9 was associated with Enneking stage and metastasis(all P＜0.05).Kaplan‐Meier analysis showed that the survival duration of patients with positive ERK5 and MMP‐9 expression levels was shorter than those of the patients in the negative expression groups(all P＜0.05).Univariate analysis of COX proportional hazards regression model revealed that tumor size,Enneking stage,metastasis,and positive ERK5 and MMP‐9 expression levels are relevant to the overall survival of patients with osteosarcoma(all P＜0.05).Multi‐variate analysis of COX proportional hazards regression model confirmed that Enneking stage,metastasis,and positive ERK5 and MMP‐9 expression levels can act as independent prognostic factors for osteosarcoma patients(all P＜0.05).Conclusion:The ERK5 and MMP‐9 expression levels are high in osteosarcoma tissues and are related to the clinical characteristics and prognosis of patients with osteo‐sarcoma.Thus,ERK5 and MMP‐9 expression levels may play important roles in osteosarcoma development and progression.

osteosarcoma,ERK5,MMP‐9,immunohistochemistry,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.14.146

①兰州大学第二医院骨科（兰州市730030）；②甘肃省骨关节疾病研究重点实验室；③甘肃省肿瘤医院骨软组织肿瘤科

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81672207）资助

夏亚一xiayayi@126.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81672207)