椒样薄荷脱毒苗的规模化生产研究

郭丹丽 王自健 蒋新明 路喆 李敏 徐盼盼 王朴

摘要[目的]更新伊犁地区的椒样薄荷品种，对伊犁地区椒样薄荷进行提纯及复壮。[方法]采用组培技术对椒样薄荷品种进行茎尖脱毒、离体快繁及大规模生产。以椒样5号为材料，研究大规模生产下椒样薄荷茎尖分化、增殖、生根的最适激素浓度。[结果]可使用白砂糖和琼脂条代替蔗糖、琼脂，降低经济成本；大规模生产时，最适椒样薄荷增殖培养基为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，最适生根培养基为1/2 MS+0.10 mg/L NAA。[结论]大规模组培不同阶段所使用基本培养基不同，激素组合也不同，大规模生产时以经济节约为主；利用茎尖快繁技术可快速更新换代椒样薄荷品种。

关键词椒样薄荷；脱毒苗；组织培养；提纯；复壮

中图分类号S567.23+5文献标识码A文章编号0517-6611（2017）17-0122-02

Abstract[Objective]To update the peppermint cultivated varieties in Yili area， purify and rejuvenate Yili peppermint. [Method]Shoot tip detoxification， in vitro rapid propagation and mass production of peppermint varieties were conducted by tissue culture technology.Using No.5 pepper as the material， the optimum hormone concentration of peppermint tip differentiation， proliferation and rooting in large scale production was studied.[Result]Sugar and agar bars can be used instead of sucrose and agar to reduce economic costs. In mass production， the optimum proliferation medium of peppermint was 1/2 MS+0.5 mg/L 6BA+0.01 mg/L NAA， and the optimum rooting medium was 1/2 MS+0.10 mg/L NAA. [Conclusion]The basic medium used in different stages of tissue culture was different， and the hormone combinations were different. The technique of rapid propagation of stem tip can be used to quickly update peppermint varieties.

Key wordsPeppermint；Virusfree seedling；In vitro culture；Purify；Rejuvenation

基金項目兵团科技攻关与成果转化项目（2016AC027）；兵团科技支疆项目（2014AB010）；师域发展创新支持计划（2015AF011）。

作者简介郭丹丽（1989—），女，新疆伊犁人，助理研究员，从事特色作物遗传育种研究。*通讯作者，研究员，从事特色作物研究。

收稿日期2017-04-13

新疆椒样薄荷的栽培种植已有50多年的历史，种植面积占到全国种植面积的85%以上，已成为我国最重要的椒样薄荷栽培基地。由于椒样薄荷的栽培历史悠久，品种更新速度慢，再加上容易感染病毒，伊犁地区种植的椒样薄荷优良性状退化，严重影响了椒样薄荷的产量和经济效益，制约了薄荷产业的发展。目前国内主要采用茎尖剥离方式来脱去危害薄荷的主要病毒[1]，此方法可有效解决因病毒病而导致的产量、品质下降问题，不仅可以短时间内获得大量的无病毒苗，还保证了各品种的优良性状。茎尖脱毒方法已被广泛地运用到甘蔗[2]、马铃薯[3]、人参果[4]等多种植物中，脱毒效果十分明显。为了改善品种退化、病毒病等严重影响伊犁地区椒样薄荷产业发展问题，该试验针对伊犁地区椒样薄荷主栽品种开展脱毒及组织培养研究，探索在大规模培养条件下椒样薄荷茎尖成苗的培养基配方。利用茎尖脱毒对伊犁地区种植的椒样薄荷进行提纯复壮，大规模快速生产椒样薄荷脱毒种苗，为解决伊犁地区椒样薄荷品种退化问题、大规模生产椒样薄荷原原种苗奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为伊犁地区主要种植的薄荷品种椒样5号。

1.2方法

1.2.1培养基制备。

以MS为基本培养基，加入蔗糖3%、琼脂0.7%，pH調至5.8，在121 ℃高温下灭菌20 min，等温度压力降下来后，取出培养瓶置于超净工作台上。

1.2.2外植体消毒。

选取椒样5号生长健壮的匍匐茎段，流水冲洗30 min，然后剪取带腋芽茎段或茎尖1 cm左右，70%乙醇浸泡40 s，0.1%升汞消毒浸泡5～6 min，取出材料用无菌蒸馏水冲洗5～6次，每次1 min，冲洗完毕用无菌滤纸吸干水分待用。

1.2.3建立无菌区。

将消毒后的材料用剪刀剪一个斜面，将茎段或茎尖（新剪的切口斜面）放置到事先配制好的普通MS培养基上进行培养，温度（24±2）℃，光照2 500 lx，光照时间16 h/d。3 d后观察，如果发现瓶内有霉菌或细菌污染的材料应及时清理，注意要整瓶移走清理，避免污染其他瓶苗。

1.2.4茎尖脱毒。

待瓶苗新的幼芽长至1～2 cm时，可进行脱毒工作。在无菌条件下使用解剖镜观察，采用镊子剥去多余的叶片，露出生长点，用解剖刀切取0.2～0.5 mm的茎尖，放到不同浓度6-BA（1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、020 mg/L）组合的培养基中进行培养。20 ℃暗培养22～26 h后，转到培养温度为70 ℃，光照强度2 000～2 500 lx，光照时间16 h/d的条件下培养，25 d后统计成活率和脱毒率。

1.2.5优化培养基。

以MS为基本培养基，将MS培养基中的蔗糖用普通的白砂糖代替，琼脂粉用普通的琼脂条代替，其余成分不变，配制成优化后的MS基本培养基。分别用普通培养基和优化后的培养基培养幼芽，20 d后观察其生长情况。

1.2.6继代培养。

将长出的嫩芽接种到增殖培养基上，以MS培养基和1/2MS培养基为基本培养基，分别添加6-BA（0.5、1.0 mg/L）和NAA（0.01、0.05 mg/L）的激素组合。在培养温度为28 ℃，光照强度2 500 lx，光照时间16 h/d条件下培养，每5 d观察1次，25 d后各处理随机统计5瓶，观察幼苗的生长情况。

1.2.7生根培养。

将伸长的侧芽剪成5～8 cm的茎段，接种到添加6-BA（0、0.5 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.50 mg/L）的1/2 MS培养基上，20 d后統计生根数，各处理随机统计5瓶。

2结果与分析

2.1不同激素组合对椒样薄荷脱毒成活的影响

切取椒样薄荷茎尖0.2～0.5 mm后，放到不同激素配比的培养基中进行试验，由表1可知，不同激素配比均可诱导茎尖分化出椒样薄荷幼苗，激素水平不同對其诱导小苗的成活个数有较大的影响，2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA激素处理最有利于茎尖幼苗的成活。不同激素配比对诱导出的幼苗脱毒率没有明显影响。

2.2椒样薄荷基本培养基的优化

由于该研究为大规模工厂化育苗做准备，一切以成本最小化为标准，试验将基本培养基中的蔗糖换为白砂糖，琼脂粉换为琼脂条，其他成分不变。对椒样薄荷进行培养发现，优化后的培养基对椒样薄荷组培苗的影响不大。故椒样薄荷的增殖培养和生根培养采用改良之后的培养基作为基本培养基。

2.3不同激素组合对椒样薄荷继代繁殖的影响

通过观察发现，将幼苗转入增殖培养基培养10 d后椒样薄荷茎节明显伸长并发出少量叶芽，15 d后侧芽不断伸长且长势良好，20 d后部分外植体茎段基部膨大处有少量根系长出。25 d后侧芽长度一般为5～9 cm，平均有2～4个茎节。由表2可以看出，25 d后不同处理侧芽生长情况均比较良好，MS基本培养基中侧芽的萌发和生长要优于1/2 MS基本培养基中，但二者不存在显著性差异，所有茎段基部膨大，未出现愈伤组织，部分处理有少量根系生成。外援添加激素可改变外植体的新增茎节数，以激素处理0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA为最好。

2.4不同激素组合对椒样薄荷生根的影响

增殖培养下，1/2 MS培养基对椒样薄荷的增殖率没有显著影响，暗示无机盐浓度对椒样薄荷的生长差异不大，再加上大量培养时从节约成本考虑，生根培养将以1/2 MS培养基作为基本培养基进行试验。接种10 d后，6个处理茎段基部均长出白色根系，继续生长，到接种20 d时，每株6～9条根，差异不是很明显，具体根系生长情况见表3。经比较，生根阶段采用1/2 MS+0.10 mg/L NAA有利于根系生长。

3结论与讨论

该研究采用茎尖处理对椒样薄荷进行脱毒，切取0.2～0.5 mm茎尖进行培养，成活率、脱毒率最高，均为77.7%。谢文申等[1]使用热处理结合茎尖培养法对野薄荷进行脱毒，切取0.3～0.5 mm茎尖培养，其成活率为50%，而脱毒率可达80%，可能是由于茎尖培养所使用的培养基不同引起的。同张倩等[5]的研究一样，该研究发现在继代和增殖培养过程中，使用1/2 MS基本培养基就可以满足椒样薄荷所需的营养，有效节约了生产成本。

由于过高浓度的激素处理会使组培苗出现玻璃化现象，该研究采用较低浓度的激素进行增殖培养，发现低剂量的激素处理椒样薄荷，未出现椒样薄荷玻璃化现象，且新增的茎节数也较多，激素水平为0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA时增殖达到最优，激素水平为0.10 mg/L NAA时生根水平达到最优。该研究对椒样薄荷进行大规模的组织培养试验，结果与王小敏等[6]的研究结果有少许出入，可能是由于椒样薄荷对激素的要求较低，只需要少量的植物激素就可满足分化增殖条件，也可能是使用的基本培养基不同造成的。

参考文献

[1] 谢文申，付晏昆，周露，等.野薄荷组织培养脱病毒技术研究[J].现代农业科技，2016（6）：61-62，64.

[2] 陈玉霞，邱建辉，张朝臣，等.甘薯茎尖脱毒培养技术研究[J].安徽农业科学，2016，44（13）：135-137，219.

[3] 刘江娜，李东方，张爱萍，等.不同品种马铃薯茎尖脱毒培养方法优化技术研究[J].新疆农业科学，2014，51（2）：284-290.

[4] 翟进升，邹爱兰，常兴亚.人参果茎尖脱毒培养与快速繁殖[J].植物资源与环境学报，2004，13（3）：41-43.

[5] 张倩，管远清，李青.不同培养基类型对薄荷组织培养的影响[J].山东农业科学，2014，46（11）：30-31，38.

[6] 王小敏，李维林，梁呈元，等.椒样薄荷的组织培养研究[J].安徽农业科学，2007，35（11）：3159-3160，3162.