大孔吸附树脂法分离纯化葡萄籽中原花青素

马小琴，王晓敏，周凡

（新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆乌鲁木齐830011）

大孔吸附树脂法分离纯化葡萄籽中原花青素

马小琴，王晓敏，周凡*

（新疆华世丹药物研究有限责任公司，新疆乌鲁木齐830011）

研究大孔吸附树脂法纯化分离原花青素的工艺条件及参数。采用香草醛-硫酸方法进行分光光度法测定，考察AB-8大孔树脂对原花青素的吸附率、吸附量、解吸附率、纯度。结果表明：上样液中原花青素含量在4.5 mg/mL～6.5 mg/mL范围较为合适，当AB-8树脂与提取液的比例为1∶10（g/mL），上样流速为1.5 BV/h，吸附时间为8 h时，吸附率达到95%以上；以40%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱剂用量为6 BV，解析率为99%，此条件下得到的固体纯度为94.7%，用AB-8型大孔树脂分离，纯化原花青素的方法可行。

大孔树脂；葡萄籽；原花青素；纯化

葡萄籽中含有大量原花青素，原花青素是由单体黄烷-3-醇以不同聚合度链接而成的多酚类化合物[1]，研究表明，原花青素拥有显著的抗氧化和改善微循环功能，此外还具有护肝解毒、降血压、降血脂、消炎、抗癌、治疗心血管疾病等功效[2-3]，广泛应用于保健品、化妆品、食品等行业。

AB-8大孔吸附树脂具有再生简便、解析条件温和、使用周期长、节省费用等诸多优点，是一种性能良好的原花青素吸附剂[4]。本文拟采用乙醇超声波辅助提取葡萄籽原花青素，研究AB-8大孔树脂对葡萄籽中原花青素提取液的纯化技术，考察最佳上样量、最佳上样浓度、最佳上洋流速、最佳洗脱剂及用量等对纯化效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

葡萄籽：新疆华世丹药业股份有限公司。

AB-8型大孔吸附树脂：天津市光复精细化工研究所；原花青素标品（纯度为98%）：北京盈泽纳新化工技术研究院提供；氢氧化钠、甲醇：国药集团化学试剂有限公司；盐酸、硫酸：西安化学试剂厂；无水乙醇：天津市百世化工有限公司；香草醛：天津基准化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

KQ-500DW型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；R-1010型旋转蒸发仪：郑州长城科工贸有限公司；TU-1950紫外-可见分光光度仪：北京普析通用仪器有限责任公司；十万分之一分析天平：余姚市金诺天平仪器有限公司；SHZ-82A水浴恒温震荡器：江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

精密称取原花青素标准品9.49 mg，用无水乙醇溶解并定容至10 mL配成标准储备液；用移液管分别移取标准储备液适量，配制浓度分别为0.047 45、0.094 90、0.118 75、0.142 35、0.189 8、0.237 5、0.287 5 mg/mL原花青素标准溶液。精密量取原花青素标准溶液1.0 mL，依次加入3%香草醛-甲醇溶液5 mL；30%硫酸-甲醇溶液5 mL；混合均匀后在水浴锅中恒温（30℃）避光反映15 min。以3%香草醛-甲醇溶液：30%硫酸-甲醇溶液：无水乙醇=5∶5∶1的混合溶液为空白对照，在502 nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，用二元回归法绘制标准曲线。回归方程为

Y=2.107 5X+0.006 4，R2=0.999 9

式中：Y是吸光度值；X是原花青素浓度，mg/mL。

1.2.2 葡萄籽原花青素的提取工艺

精确称取脱脂干燥并过2号筛的葡萄籽提取物适量，加入10倍量50%乙醇溶液，提取温度为60℃，置200 W超声水浴中回流提取40 min，提取2次，过滤、合并滤液，减压回收至无醇味，得葡萄籽原花青素浓缩液。然后选用AB-8型大孔树脂进一步纯化。

1.2.3 AB-8树脂对葡萄籽提取液中原花青素的吸附试验

1.2.3.1 AB-8型大孔吸附树脂的预处理

将AB-8用蒸馏水浸泡充分溶胀，再用5%HCl和2%NaOH酸碱重复处理2次后，然后用蒸馏水洗至中性。用95%乙醇浸泡12 h充分溶胀，滤去水及浮游物和破碎树脂后洗至澄清，再用NaOH（0.5 mol/L）浸泡8 h～10 h并不时搅拌，除去碱液水至中性，再经HCl（0.5 mol/L）浸泡8 h～10 h并不时搅拌以除去新树脂中的各种杂质，除去酸液水洗至中性，再用70%乙醇浸泡4 h～6 h并不时搅拌，除去溶剂后继续用70%乙醇洗至洗出液滴入水中不呈现乳白色浑浊为止，最后用蒸馏水洗去溶剂。

1.2.3.2 AB-8大孔树脂对葡萄籽提取液中原花青素静态吸附试验

准确称取经预处理的AB-8型树脂适量，置于250 mL锥形瓶中，精密加入葡萄籽提液液50 mL，置于恒温摇床中，25℃下振荡24 h，每隔一段时间进行取样一次，测其原花青素含量，绘制静态吸附动力学特征曲线。测定滤液的原花青素含量，并计算AB-8树脂对葡萄籽原花青素静态吸附量、吸附率。

吸附量/（mg/g）=（样品原花青素总量-吸附后滤液中原花青素总量）/树脂的重量

吸附率/%=（样液原花青素总量-吸附后滤液中原花青素总量）/样液原花青素总量×100

1.2.3.3 AB-8大孔树脂对葡萄籽提取液中原花青素动态吸附试验方法

量取葡萄籽提取物溶液适量，分别缓慢地加入装有AB-8树脂的层析柱中，控制流速分别为1、1.5、2.0、2.5 BV/h，收集流分，测定不同流速的原花青素含量。吸附饱和后的树脂用不同乙醇对其进行洗脱，收集洗脱液，依次测定原花青素含量，计算原花青素动态饱和吸附率、解析率和纯度。

解析率/%=洗脱液中原花青素的总量/（样品原花青素总量-吸附后滤液中原花青素总量）×100

纯度/%=产物中原花青素的质量/产物的质量×100

2 结果与分析

2.1 AB-8树脂对葡萄籽提取液中原花青素静态吸附效果

2.1.1 AB-8树脂的用量对静态吸附作用的影响

AB-8树脂与提取液按不同的比例混合，分析树脂对原花青素的吸附效果，树脂用量对静态吸附作用的影响如图1所示。

图1 树脂用量对静态吸附作用的影响Fig.1 The effect of resin dosage on static absorption

由图1结果表明，树脂与提取液的比值为1∶10（g/ mL）时，对原花青素是吸附率最高（95.58%）；当树脂与提取液的比值在1∶35（g/mL）后，其吸附量基本无变化，达到平衡；本因素试验，以吸附率为考察指标，最终确定树脂与提取液的比值为1∶10（g/mL）。

2.1.2 提取液中原花青素浓度对吸附作用的影响

用不同原花青素含量的提取液进行静态吸附试验，提取液原花青素浓度对静态吸附效果的影响如图2所示。

图2 提取液原花青素浓度对静态吸附效果的影响Fig.2 The effect of procyanidins concentration on static absorption efficiency

由图2可知，提取液的原花青素含量在4.0mg/mL～6.5 mg/mL时，吸附率较大且相近；提取液中原花青素含量在8 mg/mL时吸附量较高，但此时吸附率很低；因此综合考虑，以吸附率与吸附量为指标，最终确定上样液浓度为4.5 mg/mL～6.5 mg/mL。

2.1.3 作用时间对静态吸附作用的影响

AB-8树脂对葡萄籽原花青素的静态吸附进程如图3所示。

图3 AB-8树脂对葡萄籽原花青素的静态吸附进程Fig.3 The static absorption progress of AB-8 resin on procyanidins in grape seeds

由图3结果可知，树脂对葡萄籽原花青素的静态吸附时（AB-8树脂与提取液以1∶10（g/mL）的比例），在0～24 h内，随着时间的增加，树脂的吸附率与吸附量显著增加，在0～2 h内增加速度最快，当吸附时间达到8 h时，吸附率为72.95%、吸附量为103.104 mg/mL，随后树脂对原花青素的吸附效果变化不大。因此，确定一般为8 h。

2.2 AB-8树脂对葡萄籽提取液中原花青素动态吸附效果

2.2.1 流速对动态吸附作用的影响

上样流速是影响大孔树脂吸附效率的关键因素，若上样速度过快，会使得原花青素吸附量减少，导致原花青素样品的浪费；若上样流速太慢，虽然可以使大孔树脂充分吸附原花青素，但是耗时较长，影响效率。上样流速对葡萄籽原花青素吸附效果的影响如图4所示。

图4 上样流速对葡萄籽原花青素吸附效果的影响Fig.4 The effect of flow rate on procyanidins absorption

由图4可知，上样速度越慢，大孔树脂吸附率和吸附量越大；上样流速达到2 BV/h后，吸附率与吸附量明显下降，上样液在1.0 BV/h～1.5 BV/h间，吸附率与吸附量差别不大，考虑到时间成本，最终确定上样流速为1.5 BV/h。

2.2.2 洗脱液的浓度对动态洗脱效果的影响

采用不同浓度的乙醇溶液对吸附于树脂上的原花青素进行洗脱，确定洗脱液。不同浓度乙醇溶液的解吸效果如图5所示。

图5 不同浓度乙醇溶液的解吸效果Fig.5 The desorption of different concentration alcohol

图5结果表明，随着乙醇浓度的升高，解吸率与纯度均有一个先上升后下降的趋势。孙芸等研究认为，低浓度乙醇（低于40%）可洗脱原花青素的单体及低聚体（有活性部分），40%以上的乙醇可洗脱原花青素的高聚体[6]。同时，乙醇浓度越高，解吸液杂质含量也越多，纯度越低。因此综合考虑树脂解吸率、洗脱原花青素的种类及纯度，选择40%乙醇作为葡萄籽原花青素的解吸剂。

2.2.3 洗脱时的动态解吸分析

用40%乙醇溶液对吸附于树脂上的原花青素进行洗脱，分段对流出液进行分析，测定洗脱率。动态解吸附曲线如图6所示。

图6 动态解吸附曲线Fig.6 The dynamic desorption curve

图6结果表明，通过第1个100 mL时，原花青素开始被洗脱下来，然后在第2个100 mL迅速达到高峰；在第9个100 mL后，吸附在树脂上的原花青素就被完全洗脱下来，并且曲线出峰很快，无明显拖尾。最终换算成柱体积后，则40%乙醇溶液的使用量为6 BV。

2.3 验证试验

为了确认纯化条件组合生产条件的再现性，进行了验证试验。将预处理的AB-8型树脂100 g，进行湿法装柱，分别加入葡萄籽提取物溶液，树脂与提取液比例为1∶10（g/mL），以1.5 BV/h的流速进行动态吸附，纯化水洗至洗脱液中不含有原花青素，弃去流出液。最后以40%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱剂用量为6 BV进行解吸附。洗脱下的溶液进行浓缩，烘干。称其固体含量，计算纯度，结果见表1。

3 结论

通过单因素试验，上样液中原花青素含量在4.5 mg/mL～6.5 mg/mL范围较为合适，当AB-8树脂与提取液的比例为1∶10（g/mL），上样流速为1.5 BV/h，吸附时间为8 h时，吸附率达到99%以上；以40%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱剂用量为6 BV时，解析率为98%，此条件下得到的固体纯度为94.7%，说明用AB-8型大孔树脂纯化葡萄籽中原花青素的结果可行。

表1 验证试验结果Table 1 Results of confirmatory experiment

[1]王璐,郑茂强,王猛,等.葡萄籽原花青素的分离纯化研究[J].粮食与食品工业,2009,16(1)：26-28

[2]赵文恩,韩桂花,焦凤云.葡萄籽原花青素提取工艺研究[J].食品科学,2002,23(8)：108-110

[3]张瑜,张换换,李志洲,等.红毛丹果皮中原花青素提取及其抗氧化活性研究[J].食品研究与开发,2011,32(1)：188-192

[4]丁利君.AB-8树脂对半边旗提取液中黄酮的吸附作用[J].食品科学,2007,28(10)：241-244

[5]孙芸,徐宝才,谷文英,等.AB-8树脂对葡萄籽原花青素按聚合度分离特性的研究[J].食品科技,2007(6)：60-63

Separation and Purification of Procyanidins in Grape Seed with Macroporous Adsorption Resin

MA Xiao-qin，WANG Xiao-min，ZHOU Fan*
（Xinjiang Hua Shidan Pharmaceutical Reaearch Co.，Ltd.，Urumqi 830011，Xinjiang，China）

To optimize the technical parameters of optimize the technical parameters of procyanidins separation and purification with macroporous resin.The vanillin-sulfuric acid spectrophotometry was used to investigate adsorption rate，adsorbtion capacity，eluting rate and purity of procyanidin.The results indicated that the optimum ranges of procyanidin in sample solution was 4.5 mg/mL to 6.5 mg/mL.The rate of AB-8 resin and reagent was 1∶10（g/mL），the flow rate was 1.5 BV/h and the adsorbtion time was 8 h，the adsorbtion capacity of procyanidin was more than 95%.The eluting rate of procyanidin and the purity of solid were 99%and 94.7%，respectively，by using 40%ethyl alcohol as eluent with 6 BV of dosage.The macroporous adsorption resin method is reliable and can be applied for separation and purification of procyanidin.

macroporous resin；grape seed；procyanidins；purification

2016-10-21

新疆生产建设兵团中青年科技创新领军人才（2015BC001）作者简介：马小琴（1988—），女（回），助理工程师，学士，主要从事药物制剂研究。

*通信作者：周凡（1984—），女（汉），工程师，硕士，主要从事药物制剂研究。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.012