辣椒品种镇研2 2种子纯度的S S R分子标记鉴定

卢国强卢海林潘学春张正锋吉振勇王 云

（1. 镇江市镇研种业有限公司， 江苏镇江 212013； 2. 江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

辣椒品种镇研2 2种子纯度的S S R分子标记鉴定

卢国强1卢海林1潘学春1张正锋1吉振勇1王 云2

（1. 镇江市镇研种业有限公司， 江苏镇江 212013； 2. 江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

分子标记技术因其具有高效、稳定、可靠等优点越来越多地被应用到种子纯度鉴定中；而基于分子标记的辣椒（Capsicum annuum L.）杂交种子纯度快速检测技术体系的建立对辣椒杂交品种的选育和生产则具有重要的意义。以辣椒杂交品系镇研22及其两亲本为试验材料，利用SSR分子标记技术对辣椒杂交品种间的多态性进行了引物筛选和种子纯度鉴定研究。结果表明，从20对SSR引物中筛选出CAMS-327引物，在亲本和杂交种中表现出稳定的共显性，并对镇研22杂交种进行纯度鉴定，结果为98%，与田间鉴定结果基本一致；SSR 标记分析可实现对辣椒杂交品种种子纯度的快速和准确鉴定。

辣椒；种子；纯度鉴定；SSR标记

AbstractThe molecular marker technique has been applied to the identification of seed purity increasingly due to its advantages of being effcient, stable and reliable. DNA-based assessment of seed purity is one of the most important quality control components in hot pepper (Capsicum annuum L.) hybrid seed production. In this study, the seed genetic purity of hot pepper hybrid cultivar Zhenyan 22 was analyzed with SSR marker, genomic DNA from the Zhenyan 22 and its parental lines was screened with 20 pairs of SSR primers, from which one pair of primers CAMS-327 that could perform stable co-dominance in the parental lines and hybrids and produce both female and male parent specifc markers was selected for the genetic purity test, and a total of 45 hybrid individuals were analyzed with the identified primer. The results showed that the overall genetic purity of the hybrid seed Zhenyan 22 was at 98% which was relatively consistent with that of the feld test. The combination of DNA extraction and SSR marker analysis is a rapid and accurate method for the detection of hybrid hot pepper variety seed purity.

Key wordsCapsicum annuum L；seed；purity assessment；SSR marker

1 前言

辣椒 (Capsicum annuum L.)是我国主要的蔬菜作物之一。种子纯度表示品种在特征特性方面典型一致性的程度，即样品中待测品种种子数或株数占供检样品种子总粒数或总株数的百分比。纯度鉴定是商业育种中不可或缺的重要步骤，是衡量种子质量的重要指标，是保证优良品种增产潜力得以发挥的关键因素。在辣椒育种过程中，利用杂种优势选育品质优、产量高的杂交种，是一条行之有效的途径。辣椒杂种一代绝大多数是通过人工去雄授粉而来，由于辣椒花期长且多次开花，难免会造成自花授粉而产生伪杂种，因此，为保证优良品种增产潜力得以发挥，杂种纯度鉴定尤其重要。

传统的种子纯度鉴定主要依赖于田间植物形态学或同工酶等来判断，其生产周期长，用地多，不仅费时费工且易受环境因素影响，准确性难以保证。随着DNA分子标记技术的问世及迅速发展，使得从基因组水平上检测杂交种纯度成为可能[1,2]。在利用DNA分子标记技术构建辣椒指纹图谱及杂交种纯度鉴定方面，已经开发应用有RAPD、SRAP、AFLP和SSR等分子标记[3-5]。其中，SSR标记因具有操作简单、数量丰富、在染色体上均匀分布、共显性遗传、稳定性和重复性好等优点，因而在辣椒[6]、萝卜[7]、黄瓜[8]、茄子[9]、西瓜[10]等多个蔬菜作物品种纯度鉴定中得到广泛应用。

本研究以镇江市镇研种业有限公司选育的辣椒品种镇研22及其亲本为试验材料，利用SSR 分子标记技术进行种子纯度鉴定研究，筛选出双亲互补，特异性强、稳定性高的SSR 引物，并以该谱带作为分子标记对其辣椒种子纯度进行鉴定，建立准确快速的辣椒杂交种种子纯度的鉴定方法，为辣椒种子纯度分析及杂交育种和生产提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 材料

试验所用的镇研22及其父母本均由镇江市镇研种业有限公司提供。将F1代和父母本种子置于30℃条件下催芽3 d后，播种到含草炭基质的育苗盘中进行育苗，温室培养至6片真叶时取样本叶片提取DNA。

2.2 DNA的提取

DNA的提取采用CTAB法[11]。辣椒叶片于研钵中磨碎后转移至50 mL离心管，加入DNA 提取缓冲液（1% CTAB、0.7 M NaCl、10 mM EDTA、20 mM β-巯基乙醇），将混合液置于65℃振荡水浴90 min，冷却后加入等体积氯仿/异戊醇溶液，两者体积比为24∶1，混匀、5 000 g 离心10 min。将上清液转移至另一灭菌离心管中，加入1倍体积异丙醇，混匀，5 000 g离心10 min，去上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，双蒸水溶解。DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测、紫外分光光度计测定浓度和纯度后，于4℃下保存备用或于-20℃下长期保存。

2.3 SSR扩增与检测

引物设计参照Minamiyama 等[12]发表的106对SSR引物序列，随机合成20对，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR采用20 µL体系，包含40～ 50 ng 模板DNA，3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.25 µmol/L引物，1 U Taq酶。SRAP扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸7 min。PCR产物经7%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染显色。

3 结果与分析

3.1 辣椒叶片基因组DNA的提取与检测

用改良CTAB法提取辣椒叶片基因组DNA，A260 nm /A280 nm z的比值在1.8 ～ 2.0 之间，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测显示无明显DNA降解、质量良好（图1），能够满足SSR检测的要求。

图1 辣椒基因组DNA的凝胶电泳检测

3.2 特征引物的筛选

本研究利用20对SSR引物分别对辣椒品种镇研22父母本进行多态性筛选，其中CAMS-327引物在镇研22父母本中能扩增出稳定、清晰的特异性互补条带，扩增结果见图2。因此，本研究选取这对引物用于镇研22的种子纯度鉴定。

3.3 杂种纯度的鉴定

随机选取45粒镇研22辣椒种子，育成幼苗后提取DNA，并以CAMS-327为引物进行SSR扩增，检测辣椒种子的纯度。检测结果表明：镇研22种子中有1株呈现出母本特征谱带，44株呈现杂交一代特征谱带，杂交种子纯度为98%（图3）。通过大田种植，根据植株表型鉴定，在200株镇研22群体中，有6 株表型表现与亲本一致，田间鉴定种子纯度为97%，与分子标记鉴定结果基本一致。

图2 引物CAMS-327对镇研22及其亲本的扩增结果

4 讨论

目前辣椒杂交种纯度主要的鉴定方法有田间形态学鉴定法和生化检测法等。形态学鉴定法易受环境条件的限制，费时费力，鉴定的准确性也受观察者经验的制约；生化检测技术操作过程复杂，费事费钱，都不能满足种子纯度鉴定和育种工作发展的需要。分子标记技术因其准确、快速、稳定、不受基因表达和环境因素影响，且不受器官、组织及发育特异性等限制，已逐步成为作物杂交种纯度检测的主要工具。SSR 标记数量丰富，在植物基因组上均衡分布，共显性遗传，稳定性和重复性较好，是进行作物杂交种纯度鉴定理想的标记类型。本研究利用SSR 标记检测镇研22杂交种纯度，其结果镇研22杂交种纯度为98%，分子标记鉴定结果与田间鉴定结果基本一致，杂交种中混杂了母本自交种， 可能是由于去雄不彻底导致的母本自交种。该结果说明本试验建立的SSR 技术体系可用于辣椒杂交种纯度的快速检测。

图3 CAMS-327在镇研22单株及亲本中的扩增结果

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Genetic Purity Assessment of Hybrid Variety Zhenyan 22 with SSR Markers in Hot Pepper

LU Guoqiang1LU Hailin1PAN Xuechun1ZHANG Zhengfeng1JI Zhenyong1WANG Yun2
（1. Zhenjiang Zhenyan Seeds Co., Ltd., Zhenjiang 212013, China; 2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China）

2017-06-19

镇江市农业科技支撑计划（NY2015014）

卢国强（1975-），男，高级农艺师，主要从事辣椒新品种的选育及推广工作；Tel：13914555188；E-mail：zy.seed@163.com