分子标记技术在辣椒雄性不育中的研究进展

孟雅宁 严立斌 范妍芹

（河北省农林科学院经济作物研究所， 石家庄 050051）

分子标记技术在辣椒雄性不育中的研究进展

孟雅宁 严立斌 范妍芹*

（河北省农林科学院经济作物研究所， 石家庄 050051）

辣椒是常异花授粉植物，杂交制种成本较高，种子的纯度难以保证，这使得辣椒杂交种的利用受到一定的限制，辣椒育种技术能力亟待提升。而辣椒雄性不育材料的发现及其遗传研究为辣椒杂交种的利用提供了很好的遗传资源和技术理论基础。利用雄性不育育种可以降低制种成本，作为辣椒育种的主攻方向，近年来受到越来越多的科研院所重视。介绍了多种分子标记技术的特点，阐述了有关辣椒雄性不育研究的进展，涉及已被利用的遗传类型、不育系和恢复系的研究，并对近年来开发的不育和保持基因标记、恢复基因标记进展进行了描述，以期为国内辣椒育种研究者提供参考。

辣椒；雄性不育；分子标记

AbstractHot pepper is an often cross-pollinated plant, the cost of its hybrid seed production is higher and its seed purity is diffcultly ensured, which limits the use of hot pepper hybrids to a certain extent, so the pepper breeding technology needs to be improved．The discovery and genetic study of pepper male sterile materials would provide a good genetic resource and technical basis for the utilization of pepper hybrids. The use of male sterility in pepper breeding could reduce the cost of hybrid, and as a main direction of pepper breeding, it has been paid much attention to by more and more research institutes. This paper introduces the features of many molecular marker techniques, reviews the progress in the pepper male sterility research in China, including genetic types, male sterile lines and restorer lines, and describes sterile and maintaining gene markers and restoring gene markers developed in recent years, in order to provide a reference for pepper breeding researchers in China.

Key wordshot pepper; male sterility; molecular marker technique

辣椒(Capsicum annuum L.)为常异花授粉作物，杂种优势明显，优良一代杂种比常规种一般能够增产30% ～ 50%[1]，并表现出明显的抗病抗逆性等优势。利用辣（甜）椒雄性不育系生产一代杂交种，可以省去人工去雄手续，简化制种程序，提高种子纯度。其雄性不育主要分为两种类型，一类是细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），育性由细胞质和细胞核基因共同控制；另一类是细胞核雄性不育（genic male sterility，GMS），育性仅由细胞核基因控制，不受细胞质影响。20世纪90年代以来,随着RAPD、RFLP、AFLP、SSR标记的应用和不断优化,大大丰富了辣椒标记的种类，在辣椒分子标记和遗传作图方面取得了很大的进展[2]。目前，越来越多的分子标记被用于饱和遗传图谱、构建种质系统树、分子辅助育种。

1 分子标记技术

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异，并能直接反应基因组DNA间的差异[3]。分子标记技术大致分为三类：第一类基于全基因序列的分子标记，其代表技术为RFLP、RAPD、SNP和AFLP。第二类基于简单重复序列的分子标记，指基因组中存在的由2 ～ 6个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，代表技术为SSR、ISSR和SPAR。第三类基于已知的特定序列的分子标记,指基因组上一段已知序列的、作为位置标志的单拷贝短DNA片段，主要技术为EST。目前，分子标记技术的发展十分迅速, 被广泛应用于遗传多样性分析[4-6]、图谱构建[7-8]、品种鉴定[9-10]、基因定位分离[11]、性状定位[12]、基因的表达与调控[13]和分子标记辅助选择育种[14-15]等研究领域。几种常用分子标志的特点见表1。

2 分子标记在辣椒中的应用

1956年Edwardson 提出细胞质不育类型不存在于自然界中，他将雄性不育分成核不育型和核质互作型[16]。1951年，Martin等[17]首次报道隐性单基因控制的辣椒核不育材料，揭开了辣椒雄性不育研究的序幕。Peterson[18]于1958年首次报道了辣椒的核质互作型雄性不育现象。此后，在辣椒雄性不育材料中陆续发现新的基因。

2.1 分子标记在辣椒胞质雄性不育中的应用

细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility CMC）发生的分子机理研究以及雄性不育相关基因的研究主要集中在线粒体基因上[19]。是指由于雄蕊退化、花粉败育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉的一种母性遗传现象，广泛存在于高等植物中[20]。植物胞质雄性不育由细胞质不育基因（S-）和细胞核不育基因（rfrf）共同控制，但核内恢复基因（Rf）能够抑制不育基因（S-）的表达，从而使育性恢复。在农业制种过程中，利用胞质雄性不育生产杂交种子，不但可以省去人工去雄，降低制种成本，还能确保杂交种子纯度，是植物杂种优势利用的基础和重要途径[21-23]。

表 1 不同分子标记的特点

随着近年来分子技术的迅猛发展，通过分子标记技术查找不育基因、保持基因和恢复基因，并进行基因定位，是目前做得最多的分子层面研究。Lee 等[24]报道了雄性部分恢复现象(partial restoration)，Pr/Pr 基因型的花粉表现为全可育，pr/pr 基因型的花粉表现部分可育，研究表明该基因与Rf连锁，并开发了1个与 pr紧密连锁（相距1.8 cM）的CAPS 标记PR-CAPS 和与3个Rf连锁的标记（OPP13-CAPS，AFRF8-CAPS和 CRFSCAR）。王得元[25]以辣椒细胞质雄性不育系93-A及其保持系93-B为材料，对辣椒细胞质雄性不育基因及其保持基因开展了RAPD标记研究，结果表明：OPK-17550、OPK-171500标记可能与细胞质雄性不育基因相连锁，OPH-112000标记可能与保持系中的保持基因相连锁。Kim等[26]利用2个RAPD标记OP131400（0.37 cM）、OW18800（8.12 cM）和1个CAPS标记 AFRF8CAPS（1.8 cM）对Rf基因进行了定位。王述彬[27]利用RAPD技术对细胞质雄性不育系21A与其相应保持系21B的基因组DNA进行了比较分析,在380个随机引物中找到了辣椒细胞质雄性不育系21A基因组DNA特异的RAPD片段CMS Y15500、CMS BE5850和CMS BG1900。李晶晶[2]对4 000条辣椒 EST序列进行筛选，获得了119条含有SSR的EST，共设计出35对EST-SSR引物，占所有EST序列的0.87%。以不育系、保持系基因组DNA为模板，对EST-SSR引物进行筛选，首次获得Pe21、Pe26和Pe27等3对特异引物，并扩增出特异片段分别为CMSPe2160、CMSPe26250、CMSPe27300。魏兵强等[28]利用近等基因系原理和RAPD标记技术，获得了一个与不育基因连锁的序列全长864 bp的不育标记BH19-S900。

2010年杨娟等[29]公布首次应用SSR分子标记定位了辣椒恢复基因Rf，同时选择30份恢复系辣椒材料，用AF208834引物进行PCR扩增，鉴定了Rf基因的纯合性，纯度为63.33%。刘光照等[30]利用cDNA-AFLP技术对质-核互作型雄性不育材料进行分析，在线粒体中得到差异片段并进行SNP分析。王宁[31]用423个可获得清晰目标条带的多态标记，构建了一张包含17个连锁群的密度较高的种内图谱。该图谱共372个标记，其中基于KASPar技术的SNP标记278个，SSR标记65个，CAPs标记23个，Indel标记4个，SCAR 标记1个，辣味连锁标记1个；图谱跨度1 407.0 cM，标记间平均距离3.78 cM，每个连锁群包含的标记数目在5 ～40个，连锁群的长度在 21.2 ～ 183.8 cM，图谱上的标记都与染色体相对应，这是辣椒中第一个报道的基于KASPar技术的SNP标记为主的图谱。

2.2 分子标记在辣椒细胞核不育中的应用

辣椒细胞核遗传的雄性不育（GMS）仅受细胞核内一对隐性基因控制，其选育和转育方法较简便，育成时间短，恢复谱广。目前在辣椒上发现的与GMS相关的核基因约有20个[32]。研究大多集中在辣椒核不育基因的分子标记辅助选择和育性相关基因的克隆方面[33]。

Lee等[34-36]通过运用 BSA 法和 AFLP技术找到了一个与彩色甜椒“Paprika”ms 基因紧密连锁的CAPS 标记PmsM1-CAPS，距离ms位点2～ 3 cM；获得了3个与辣椒ms3位点紧密连锁的AFLP分子标记，其中一个 AFLP标记已成功转化为CAPS标记GMS3-CAPS，能够区分纯合体和杂合体；并发现了一个与ms1紧密连锁的SCAR 标记，离ms1位点约3 cM。李国琴等[37]采用c DNAAFLP方法，从辣椒雄性不育两用系 HW58的可育株花蕾与不育株花蕾中获得阳性差异 TDF（transcription derived fragment，转录衍生片段）, 通过电子克隆获得865 bp的c DNA 序列，其与烟草CP26基因序列的同源性高达90%，命名为CaCP26（Gen Bank 登录号为 GQ999612）。韩清[33]等利用cDNA-AFLP技术，比较分析了辣椒核雄性不育两用系中不育植株与可育植株花药发育过程中基因表达的差异。用1024对选择性扩增引物进行筛选，共获得了168个转录衍生片段（transcript-derived fragment，TDFs）。通过BLAST比对分析，多数TDFs未找到对应的同源序列，可能代表了新基因；48个TDFs在数据库中找到了同源序列（Gen Bank 登录号：JK993564 ～ JK993611），并对这些序列进行功能分类。

严慧玲等[38]利用SRAP分子标记技术，筛选了225对SRAP引物组合及1393对EcoRⅠ和MseⅠ引物组合，获得了与隐性核不育基因连锁的2个SRAP标记E37M39和E44M93，其片段长度分别为200 bp和500 bp，与育性基因的遗传距离分别为6 cM和12 cM。Bartoszewski等[39]将核隐性雄性不育基因ms8定位在染色体P4的长臂上，该基因位于SCAR-P2（4.6 cM）和C2-At5g-25900（34.5 cM）标记之间，这是第一次报道辣椒核不育基因定位的连锁群与染色体编号一致。刘辰等[40]通过半定量RT-PCR 技术分析候选EST在辣椒可育株和不育株中的表达情况。利用RACE技术获得4个育性相关基因（CaSEP1、CaPROF、CaOlee 6和CaPCP）。其中，CaSEP1全长1 108 bp，编码221个氨基酸，含有一个 MADS 结构域和一个K结构域；CaPROF全长767 bp，编码131个氨基酸，含有一个PROF结构域；CaOlee 6全长523 bp，编码85个氨基酸，含有一个Olee6结构域； CaPCP全长563 bp，编码66个氨基酸。

3 展望

辣椒雄性不育是替代杂交制种中人工去雄最有效的方法，目前在韩国、印度和中国开展较多，我国很多地方已经育成了不育品种，并用于商业化杂交制种，但是利用分子标记技术进行辣椒雄性不育研究的报道还不多[41]。辣椒雄性不育的基础研究还十分薄弱，离全面认识辣椒雄性不育的机理相距甚远，发现的20个雄性不育基因除少部分精确定位到染色体上，大部分还未精确定位。2014年辣椒进行了全基因组测序，构建了高密度的连锁图谱，并组装得到高质量的基因组精细图谱，其中约90%的基因都锚定到这些染色体上[42-43]。测序的完成有助于从更深层次探索辣椒雄性不育的分子机理。

[1] 丁犁平. 辣椒杂种优势的利用[M]. 南京: 江苏科学技术出版社, 1983

[2] 李晶晶, 王述彬. ST-SSRs研究进展及其在辣椒胞质不育性研究中的应用前景[J]. 中国蔬菜, 2008(10): 40-44

[3] 王羡国, 何琳, 靳学慧, 张亚玲. 分子标记技术及其在稻瘟病抗性基因中的应用[J]. 种子世界, 2006(2): 32-34

[4] 钟淦彬, 李维国, 位明明, 郑学项, 易晓洁. SSR和AFLP分子标记鉴定巴西橡胶树种质资源的比较研究[J]. 热带作物学报, 2016, 37(10): 1855-1862

[5] Fanizza G, Chaabane R, Lamaj F, Ricciardi L，Resta P. AFLP analysis of genetic relationships among aromatic grapevines (Vitis vinifera) [J]. Theor. Appl. Genet., 2003, 107: 1043-1047

[6] Simioniuc D, Uptmoor R, Friedt W, Ordon F, Swiecicki W. Genetic diversity and relationships among pea cultivars revealed by RAPDs and AFLPs [J]. Plant Breeding, 2002, 121: 429-435

[7] Zhong D, Pai A,Yan G．AFLP-based genetic linkage map for the red four beetle (Tribolium castaneum) [J]. Journal of Heredity, 2004, 95(1): 53-61

[8] Caicedo A L, Gaitán E, Duque M C, Toro Chica O, Debouck D G, Tohme J. AFLP fngerprinting of phaseolus lunatus L．and related wild species from South America [J]. Crop Science, 1999, 39: 1497-1507

[9] Che K P, Xu Y, Liang C Y, Gong G Y, Weng M L, Zhang H Y, Jin D M, Wang B．AFLP fngerprint and SCAR marker of watermelon core collection[J]. Acta Bot. Sin., 2003, 45(6): 731-735

[10] Devanand P S, Chao C T．Genetic variation within Medjool and Deglet Noor date (Phoenix dactylifera L.) cultivrs in Califomia detected by fluorescent-AFLP markers[J]. J. HortSci.＆Biotech., 2003, 78: 405-409

[11] Julio E, Verrier J L, Dorlhac de Borne F. Development of SCAR markers linked to three disease resistances based on AFLP within Nicotiana tabacum L. [J]. Theoretical and Applied Genetics, 2006, 112: 335-346

[12] Tsarouhas V, Gullberg U, Lagercrantz U．An AFLP and RFLP linkage map and quantitative trait locus(QTL) analysis of growth traits in Salix [J]. Theoretical and Applied Genetics, 2002, 105(2-3): 277-288

[13] Bachem C W B, van der Hoeven R S, de Bruijn S M, Vreugdenhil D, Zabeau M, Visser R G F. Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fnge printing based on AFLP: analysis of gene expression during potato tuber development [J]. The Plant Journal, 1996, 9(5): 745-753

[14] Lokko Y, Danquah E Y, Offei S K, Dixon A G O, Gedil M A. Molecular markers associated with a new source of resistance to the cassava mosaic disease [J]．African Journal of Biotechnology, 2005, 4(9): 873-881

[15] 魏朔南, 赵喜萍, 田敏爵. 应用植物形态学和 AFLP 分子标记鉴别陕西漆树品种[J]. 西北植物学报, 2010,30(4): 0645-0651

[16] 吕家龙. 蔬菜栽培学各论(南方本)[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001

[17] Martin J A, Crawford J H. Several types of sterility in Capsicum frutescens [J]. Proc. Amer. Soc. Hort. Sci.,1951, 57: 335-338.

[18] 李玉宁. 灵台县早春茬露地甘蓝新品种比较试验初报[J]. 农业科技与信息, 2014(2): 52-53

[19] 魏兵强, 张淼, 王兰兰, 陈灵芝, 张茹, 侯栋, 张建农.辣椒胞质雄性不育及其育性恢复研究进展[J]. 生物技术通报, 2016, 32(4): 1-5

[20] 赵军良, 梁爱华. 高等植物细胞质雄性不育分子机理的研究进展[J]. 西北植物学报, 2004, 24(8): 1543-1546

[21] 邹学校, 马艳青, 戴雄泽, 李雪峰, 陈文超, 张竹青. 辣椒胞质型雄性不育杂交种规模制种技术[J]. 中国蔬菜, 2008(5): 45-47

[22] 陈斌, 耿三省, 张晓芬. 辣椒雄性不育杂交种规模化制种技术探讨[J]. 辣椒杂志, 2010(3): 24-27

[23] 魏兵强, 王兰兰, 陈灵芝, 张茹. 辣椒不育系制种与可育系制种相关性状的比较研究[J].长江蔬菜（学术版）, 2011(24): 10-11

[24] Lee J M, Nahm S H, Kim Y M, Kim B D. Characterization and molecular genetic mapping of microsatellite loci in pepper [J]. Theor. Appl. Genet., 2004, 108: 619-627

[25] 王得元, 王鸣, 郑学勤. 用RAPD分析辣椒细胞质雄性不育基因[J]. 核农学报, 2005, 19(2): 99-102

[26] Kim D H, Kim B D. The organization of mitochondrial atp 6 gene region in male fertile and CMS lines of pepper (Capsicum annuum L.) [J]. Curr. Genet., 2006, 49(1): 59-67

[27] 王述彬, 刘金兵, 潘宝贵. 辣椒细胞质雄性不育系与其保持系基因组DNA的RAPD分析[J]. 上海农业学报, 2008, 24(1): 8-10

[28] 魏兵强, 王兰兰, 陈灵芝. 辣椒胞质雄性不育基因的分子标记[J]. 西北农业学报, 2010, 19(10): 166-168

[29] 杨娟, 王雯, 沈火林. 辣椒恢复基因SSR标记定位及分子标记辅助选择育种[J]. 中国瓜菜, 2010, 23(5): 1-5

[30] 刘光照, 巩振辉, 黄炜, 杜羽, 吉姣姣. 辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析[J]. 中国农业大学学报, 2010, 15(5): 19-24

[31] 王宁. 辣椒胞质雄性不育恢复性 QTL 定位及不同栽培环境对其影响分析[D]. 北京: 中国农业科学院, 2016

[32] 王得元, 杨凤梅, 李颖, 王恒明. 辣椒核雄性不育基因研究进展[J]. 中国蔬菜, 2008, 1(9): 40-43

[33] 韩清, 冯淼, 刘辰, 马宁, 沈火林. 利用cDNA-AFLP技术研究辣椒核雄性不育两用系的基因差异表达[J]. 农业生物技术学报, 2012,20(10): 1117-1125

[34] Lee J, Han J H, An C G, Lee W P, Yoon J B. A CAPS marker linked to a genic male sterile gene in the colored sweet pepper, ‘Paprika’ (Capsicum annuum L.) [J]. Breeding Science, 2010, 60(1): 93-98

[35] Lee J, Yoon J B, Han J H, Lee W P, Kim S H, Park H G. Three AFLP markers tightly linked to the genicmale sterility ms3 gene in chili pepper (Capsicum annuum L.) and conversion to a CAPS marker [J]. Euphytica, 2010, 173(1): 55-61

[36] Lee J, Yoon J B, Han J H, Lee W P, Do J W, Ryu H, Kim S H, Park H G. A codominant SCAR marker linked to the genic male sterility gene (ms1) in chili pepper (Capsicum annuum L.) [J]. Plant Breeding, 2010, 129(1): 35-38

[37] 李国琴, 吉姣姣, 巩振辉, 黄炜, 李大伟. 辣椒CaCP26基因的cDNA克隆和分析[J]. 西北农业学报, 2011, 20(11): 111-116

[38] 严慧玲, 范妍芹, 严立斌, 赵付江, 周龙海. 与甜椒隐性细胞核雄性不育基因紧密连锁的SRAP分子标记的研究[J]. 华北农学报, 2011, 26(4): 42-45

[39] Bartoszewski G, Waszczak C, Gawroński P, Stepień I， Bolibok-Bragoszewska H， Palloix A, Lefebvre V, Korzeniewska A, Niemirowicz-Szczytt K. Mapping of the ms8 male sterility gene in sweet pepper (Capsicum annuum L.) on the chromosome P4 using PCR-based markers useful for breeding programmes [J]. Euphytica, 2012, 186(2): 453-461

[40] 刘辰, 马宁, 付楠, 李欣, 郭爽, 沈火林. 辣椒 GMS 育性相关候选基因的克隆及表达分析[J]. 中国农业科学, 2014, 47(16): 3264-3276

[41] 傅鸿妃, 吕晓菡, 陈建瑛, 李国景. SSR分子标记技术在我国辣椒育种研究中的应用进展[J]. 农业科技通讯, 2016(11): 168-171

[42] Qin C, Yu C S, Shen Y, et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization[J]. Preoceeding of the National Academy of Science, 2014, 111(14): 5135-5140

[43] Kim S, Park M, Yeom S I, et al. Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species[J]. Nature genetics, 2014, 46: 270-278

Research Progress in Molecular Marker Techniques on Hot Pepper Male Sterility

MENG Yaning YAN Libin FAN Yanqin*
（Institute of Economic Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051, China）

2017-02-19

国家重点研发计划(2016YFD0101704)；河北省现代农业产业技术体系蔬菜创新团队项目（HBCT2013050202）；河北省青年基金（C2016301087）；基本科研业务费（A2015050102）

孟雅宁（1984-），女，助理研究员，硕士，研究方向为蔬菜生物技术与遗传育种；Tel：0311-87652104，E-mail：yaningmeng@126.com

*通信作者：范妍芹（1961-），女，研究员，主要从事辣、甜椒栽培和遗传育种方面的研究工作；Tel：0311-87652104，E-mail：tianjiaoshi@126.com