柴胡皂苷经不同给药途径血药和脑药动力学的比较研究

戴雅洁　陈晓兰　唐红艳　邓显仪　谢浪

[摘要]通过比较柴胡皂苷经不同途径给药后血药及脑药动力学，评价柴胡皂苷治疗癫痫的最佳给药途径。柴胡皂苷经不同途径给予小鼠后于不同时间点取血和全脑，以乙腈甲醇（9∶1）沉淀血浆蛋白质，采用UPLCMS/MS测定SSa在小鼠血浆和脑组织中的浓度，用Kinetica程序软件计算药代动力学参数和生物利用度，并计算脑靶向系数（Re）和药物脑靶向指数（DTI）。鼻腔给药后脑药Re为14217%，DTI为306，要显著高于注射组。灌胃组DTI为125。柴胡皂苷鼻腔给药后脑靶向性要高于注射组和灌胃给药组，显示出鼻腔给药“引药入脑”的优势。

[关键词]柴胡皂苷； 药代动力学； 脑靶向系数； 藥物靶向指数

[Abstract]To evaluate the optimum administration routes of saikosaponin in the treatment of epilepsy by comparing the plasma pharmacokinetics and the brain pharmacokinetics after different administration routes of saikosaponin After receiving saikosaponin in different administration routes， the mice were sacrificed to collect the blood and brain tissues The acetonitrile and methanol （9∶1） were used to precipitate the plasma protein The concentration of the SSa in mice plasma and brain was determined by UPLCMS/MS， and the pharmacokinetic parameters， bioavailability， the brain targeting coefficient （Re） and the brain drug targeting index （DTI） were calculated with Kinetica software The relative brain Re was 14217% by intranasal administration， with DTI of 306， significantly higher than those by the injections； in addition， the brain DTI was 125 by gavage administration The brain drug targeting of saikosaponin by intranasal administration was higher than that by injection and gavage administration， indicating the advantages of the intranasal administration on medicine absorption into the brain

[Key words]saikosaponin； pharmacokinetics； brain targeting coefficient； drug targeting index

柴胡为伞形科植物柴胡Bulperum Chinese DC或狭叶柴胡Bulperum scorzoneri folium Willd的干燥根，性微寒，味苦、辛，归肝、胆经[1]。现代研究发现柴胡皂苷具有镇静、抗惊厥的效果，对癫痫有一定的治疗作用[2]，特别是柴胡皂苷a（SSa），其抗癫痫作用机制可能与抑制N甲基D天冬氨酸受体（NMDAR）激活，抑制NMDAR电流，调节不同的Na+通道或K+通道有关[34]。

本试验通过研究柴胡皂苷经注射、鼻腔及灌胃给药后，以SSa血药及脑药动力学变化评价柴胡皂苷经3种给药途径吸收入血、入脑的情况，以考察其最佳给药途径，为鼻腔制剂的开发提供一定的理论依据。

1材料

11仪器

UPLC Xevo TQ三重四级杆串联质谱仪（美国Waters）；色谱柱Waters BEH C18（21 mm×50 mm，17 μm）；MSS型涡旋混合机（美国Scilogex）；SK8210HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；HC2062型高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；MTN2800型氮吹浓缩装置（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；AUY220型电子天平（日本岛津）；AE/240型电子天平（上海梅特勒仪器有限公司）；单道可调移液器（上海康敏检验设备有限公式）。

12试药

色谱纯乙腈、甲醇（Merck公司）；柴胡皂苷（实验室自制）；SSa对照品（批号110777201108，中国食品药品检定研究院），供含量测定用；甲酸（CNY Technologies）；水为屈臣氏蒸馏水；其余试剂均为分析级。

13动物

昆明种小鼠，雄性，体质量18～25 g，清洁级，由重庆滕鑫生物有限公司提供，合格证号SCXK（渝）20120003。

2方法与结果

21小鼠血浆样品中SSa分析方法的建立

211色谱条件色谱柱为Waters BEH C18柱（21 mm×50 mm，17 μm）；保护柱Waters Van Guard BEH C18（21 mm×5 mm，17 μm）；流动相甲醇01%甲酸水（78∶22）；流速02 mL·min-1；柱温30 ℃。

212质谱条件电喷雾电离源（ESI）；毛细管电离电压3 kV；离子源温度150 ℃；去溶剂气温度550 ℃；喷雾气与反吹气为氮气，去溶剂气流速800 L·h-1，反吹气流速50 L·h-1；扫描方式为多反应监测离子模式（MRM），用于定量分析监测的离子反应为m/z 80364→33118（SSa）；锥孔电压为30 V；碰撞能量为50 eV。

213血浆样品的处理小鼠摘眼球取血05 mL置含有肝素钠的离心管中，1万 r·min-1高速离心10 min，吸取上层血浆100 μL，加入300 μL乙腈甲醇（9∶1）沉淀血浆蛋白，涡旋混合器振荡60 s，1万 r·min-1高速离心10 min，再取上清液350 μL氮气吹干，再加入甲醇100 μL，复溶，涡旋混合器振荡60 s，1万 r·min-1高速离心10min，取上清液2 μL进样。

214色谱行为取小鼠空白血浆、SSa对照品溶液、加入SSa对照品的小鼠血浆和尾静脉注射SSa后的小鼠血浆，按213项处理，进样分析，比较四者的色谱图，小鼠血浆中杂质不干扰SSa样品的测定，见图1。

215小鼠血浆样品标准曲线的制备取质量浓度为01，025，05，1，25，5，10，25，50，100，250，500 mg·L-1的SSa对照品溶液各10 μL置离心管中，再加入90 μL空白血浆，涡旋混匀，配制成质量浓度分别为001，0025，005，01，025，05，1，25，5，10，25，50 mg·L-1的SSa含药血浆，按213项方法处理进样分析。以SSa质量浓度（C）对进SSa峰面积（A）行线性回归，回归方程A=45 050C+7 9013，r=0999 7。结果表明小鼠血浆中SSa在001～50 mg·L-1，峰面积与血中药物浓度呈良好的线性关系。

216回收率分别取空白血浆90 μL，加入SSa对照品溶液10 μL，配制成含SSa为005，1，10 mg·L-1的血浆样品（n=5），按213项中方法操作。将所得峰面积代入标准曲线计算血浆含药量，与理论值进行比较，计算方法回收率。结果低、中、高浓度的方法回收率分别为1127%，1072%，1063%。方法回收率符合药代动力学实验要求。

分别取空白血浆90 μL，加入SSa对照品溶液10 μL，配制成含SSa为005，1，10 mg·L-1的血浆样品（n=5），按213项中方法操作。另以蒸馏水替代空白血浆进行前述样品的制备，进样分析。将所得各浓度的血浆样品峰面积与蒸馏水样品峰面积进行比较，计算提取回收率，结果低、中、高浓度的提取回收率分别为1051%，1059%，1011%。提取回收率符合药代动力学实验要求。

217精密度分别取空白血浆90 μL，加入SSa对照品溶液10 μL，配制成含SSa为005，1，10 mg·L-1的血浆样品（n=5），按213项中方法操作。于日内和3 d内各测定3批样品，所得峰面积代入标准曲线计算血浆含药量并进行比较，计算日内和日间精密度。结果低、中、高浓度日内精密度RSD分别为72%，23%，33%；日间精密度RSD分别为10%，25%，31%。精密度符合药代动力学实验要求。

218含药血浆稳定性按215项方法制备质量浓度为005，1，10 mg·L-1的含药血浆各10份，按213项处理，分别考察室温放置24 h的稳定性和冻融3 d的稳定性，进样分析。所得峰面积代入标准曲线计算浓度，评价含药血浆的稳定性。结果低、中、高浓度的含药血浆常温稳定性RSD分别为49%，38%，35%，冻融稳定性RSD分别为52%，53%，35%。说明SSa的含药血浆在常温下24 h内稳定，冻融3 d内稳定。

219最低检测限在本实验色谱条件下，最低检测限为250 μg·L-1（S/N≥3），达到SSa体内分析要求。

22小鼠全脑样品中SSa分析方法的建立

221色谱条件色谱条件同211项。

222质谱条件质谱条件同212项。

223小鼠全脑样品的提取与分离小鼠脱颈椎处死后，迅速分离出小鼠全脑，小心吸干全脑上的残留血液，并称重。按15 mL·g-1的比例加入09%氯化钠溶液，匀浆。1万 r·min-1高速离心5 min，吸取上清液200 μL，加入600 μL乙腈甲醇（9∶1）沉淀蛋白，涡旋混合器振荡60 s，1万 r·min-1高速离心10 min，吸取上清液750 μL氮气吹干，加入100 μL甲醇复溶，涡旋混合器振荡60 s，1万 r·min-1高速离心10 min，取上清液2 μL进样。

224色谱行为取空白小鼠脑匀浆、SSa对照品溶液、加入SSa对照品的小鼠脑匀浆和尾静脉注射SSa后的小鼠脑匀浆样品，按223项处理，进样分析，比较四者的色谱图，小鼠脑中杂质不干扰SSa样品的测定，见图2。

225小鼠全脑样品标准曲线的制备取空白小鼠全脑，按15 mL·g-1的量加入09%氯化钠溶液匀浆，即得空白脑匀浆液。在15 mL离心管中分别加入质量浓度为0125，025，05，125，25，5，125，25，50 mg·L-1SSa对照品10 μL，吹干后，各加入500 μL空白脑匀浆液，涡旋混合60 s，配制成质量浓度分别为25，5，10，25，50，100，250，500，1 000 ng·g-1的SSa含药脑浆，按223项处理，进样分析。以SSa浓度（C）对SSa峰面积（A）进行线性回归。回归方程A=34299C-15299，r=0999 8。结果表明小鼠脑中SSa在25～1 000 ng·g-1，峰面积与脑中药物浓度呈良好的线性关系。

226回收率取SSa对照品溶液置15 mL离心管中吹干，加入空白小鼠脑匀浆液500 μL，得到脑中药物浓度为5，50，500 ng·g-1腦匀浆液。按223项处理，进样分析。代入标准曲线计算测得的脑药含量，与理论值进行比较，计算方法回收率，结果低、中、高浓度方法回收率分别为1042%，1010%，1066%。方法回收率符合脑药代动力学实验要求。

取SSa对照品溶液置15 mL离心管中吹干，加入空白小鼠脑匀浆液500 μL，得到脑中药物浓度为5，50，500 ng·g-1脑匀浆液。按223项处理，进样分析。另以蒸馏水替代空白脑匀浆进行前述样品的制备，进样分析。将所得各浓度的脑匀浆样品峰面积与蒸馏水样品峰面积进行比较，计算提取回收率，结果低、中、高浓度提取回收率分别为 9723%，

9933%，1056%。提取回收率符合脑药代动力学实验要求。

227精密度取SSa对照品溶液置15 mL离心管中吹干，加入空白小鼠脑匀浆液500 μL，得到脑中药物浓度为5，50，500 ng·g-1脑匀浆液。按223项处理，进样分析。代入标准曲线计算测得量，测定日内和日间的变异，计算精密度，结果低、中、高浓度日内精密度RSD分别为27%，31%，22%，日间精密度RSD分别为26%，32%，17%。精密度符合脑药动力学实验要求。

228含药脑浆稳定性按225项方法制备浓度为5，50，500 ng·g-1的含药脑浆各10份，按223项处理，分别考察室温放置24 h的稳定性和冻融3 d的稳定性，进样分析。所得峰面积代入标准曲线计算浓度，评价含药脑浆的稳定性。结果低、中、高浓度的含药脑浆稳定性RSD分别为79%，40%，20%。，冻融稳定性RSD分别为52%，53%，35%。说明SSa的含药脑浆在常温下24 h内稳定，冻融3 d内稳定。

229最低检测限在本实验色谱条件下，最低检测限为250 ng·g-1（S/N≥3），达到SSa体内分析要求。

23试药配制

231柴胡皂苷滴鼻液配制复合溶媒09%氯化钠溶液乙醇丙二醇（1∶2∶2），在上述复合溶媒中加入柴胡皂苷，超声1 h使之全部溶解，即得柴胡皂苷滴鼻液，质量浓度为33340 g·L-1。按小鼠20 g計，每只小鼠给药体积为3 μL。

232柴胡皂苷注射液精密吸取上述滴鼻液15 mL，置100 mL量瓶中，以3%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）溶液分散并稀释至刻度，混匀，以022 μm微孔滤膜滤过，即得质量浓度为50 g·L-1柴胡皂苷注射液。小鼠体质量以20 g计，每只小鼠尾静脉注射02 mL。

233柴胡皂苷灌胃溶液精密吸取232项中滴鼻液75 mL，置100 mL量瓶中，以3%吐温80溶液分散并稀释至刻度，混匀，即得含量为250 g·L-1柴胡皂苷灌胃液。小鼠体质量以20 g计，每只小鼠灌胃1 mL。

234小鼠分组及给药取雄性KM小鼠120只，体质量20～25 g，随机分为3组，每组40只，分别为柴胡皂苷鼻腔组、柴胡皂苷注射组和柴胡皂苷灌胃组。动物于实验前12 h禁食，自由饮水。将3组小鼠按等剂量经鼻腔、注射和灌胃给药。

鼻腔给药时，以乙醚麻醉小鼠，固定头部，用连接PE塑料软管的微量注射器插入小鼠鼻腔内约02 cm，将定量药物给入鼻腔，观察是否有药液从小鼠鼻腔流失。各组给药后，分别在1，3，5，10，30，60，90，120 min取材，每组每个时间点5只小鼠，摘眼球取血05 mL，分离血浆备用。取血后立即脱颈椎处死小鼠，迅速分离出小鼠全脑，小心吸干全脑上的残留血液，称重。按15 mL·g-1的比例加入09%氯化钠溶液，匀浆，备用。

24小鼠经不同途径给药后SSa血药动力学数据

各组给药后，按血浆样品处理方法处理样品，UPLCMS/MS测定并计算其中SSa的浓度，平均血药时曲线见图3。

25小鼠经不同途径给药后SSa血药动力学参数

将3组血药浓度时间数据用Kinetica药动学软件拟合，拟合方法选择非房室（non compartment method）。

将鼻腔给药和灌胃给药后的SSa血药时间曲线下面积（AUC）与静脉注射给药组的AUC相比较，采用公式

F=AUC0→t（鼻腔/灌胃）/X（鼻腔/灌胃）AUC0→t（注射）/X（注射）×100%。得到鼻腔和灌胃给药后的绝对生物利用度F，其中X为给药剂量，见表1。

由表1可知，灌胃组与鼻腔组比较，AUC0→120无明显差异，但F差异有统计学意义（P<001）。鼻腔组F明显大于灌胃组，说明柴胡皂苷鼻腔给药的生物利用度明显高于灌胃。

26小鼠经不同途径给药后SSa脑药动力学数据

各组给药后，按脑匀浆样品处理方法处理样品，UPLCMS/MS测定并计算其中SSa的浓度，平均脑药时曲线见图4。

27小鼠经不同途径给药后SSa脑药动力学参数

将3组脑药浓度时间数据用Kinetica药动学软件拟合，拟合方法选择非房室。

将鼻腔给药和灌胃给药后SSa脑药时间曲线下AUC与静脉注射给药组的AUC相比较，采用公式Re=AUC（鼻腔/灌胃）AUC（注射） ×100%，得到鼻腔液和灌胃液的相对脑靶向系数Re。以鼻腔、灌胃及注射途径给药后血药浓度下面积AUC为参比，采用公式Te=AUC0→t（脑）AUC0→t（血） ，得到注射给药、鼻腔给药及灌胃给药的脑药/血药比例系数Te；以各组Te计算药物靶向指数DTI，DTI=Te鼻腔/Te注射，见表2。

由表2可知，鼻腔给药后脑内达峰时间tmax为5 min，比较注射给药3 min稍慢。鼻腔组的Re为14217%，DTI为306，注射组和灌胃组比较，差异有统计学意义。鼻腔组Re和DTI要显著高于注射组和灌胃组，说明鼻腔给药脑靶向性好，生物利用度高，而灌胃给药吸收少，生物利用度低。

3讨论

由于柴胡皂苷有溶血的副作用[5]，注射药液浓度较高会引起大鼠痉挛或死亡，影响实验结果。本试验以50 mg·kg-1尾静脉注射后不会对小鼠造成伤害。而柴胡皂苷灌胃吸收生物利用度低，在预实验和参考其他柴胡皂苷药动学的给药剂量后[6]，本试验将灌胃给药的剂量提高了25倍。

本课题通过研究柴胡皂苷不同给药途径小鼠给药后SSa血药及脑药动力学的差异，从体内过程的角度阐述不同给药途径在治疗脑病急症的优势和不足。从血药及脑药动力学过程可以看出，注射血药峰浓度是3种给药途径中最高的，Cmax为（4685±095） mg·L-1，而注射脑药浓度Cmax亦达到（53914±11412） ng·g-1。但在临床上注射给药也有一定的不良反应[78]。

虽然口服给药最易被患者所接受且治疗成本低，安全性高。但根据表1中25倍量灌胃剂量的血药浓度Cmax为（314±009） mg·L-1 ，脑药浓度Cmax为（8996±965）ng·g-1，F为207%。而根据表2中的Cmax灌胃/Cmax注射计算出脑药峰浓度仅为注射给药后的1/6，相对靶向系数Re为6460%，DTI为125。口服给药可能需要使用相当于注射给药的150倍以上的給药剂量，才能达到与注射给药相当的血内药量和脑内药量。较大的口服给药剂量和给药频率对于癫痫患者的治疗是不便的，同时也可能加重患者的肝肾负担。另一方面药物经灌胃入血和入脑都需要较长的时间，不利于癫痫患者的突发急救。

鼻腔给药后的血药浓度Cmax为（552±019） mg·L-1，脑药浓度Cmax为（44084±5579） ng·g-1可达到注射的4/5，F达4645%，Re为1422%，DTI为306，且入血和入脑速度极快，可发挥速效救急作用，使用方便，安全性也较注射剂大大提高，因此是一种值得深入开发的脑病治疗给药途径。

当然本课题是以正常小鼠为模型得到的结果，而当急性癫痫发生后，在以上3种给药途径下，血药、脑药动力学可能会有相应改变，具体情况有待进一步研究。

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[责任编辑张燕]