香青兰总黄酮对ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化病变中TGFβ1/Smad信号通路及基质金属蛋白酶表达的影响

刘杨　全翊宁　王新春　郭新红　袁勇　曹文疆　程江

[摘要]研究香青兰总黄酮（TFDM）对高脂饮食诱导载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠动脉粥样硬化形成的影响及其相关机制。采用40只SPF级8周龄雄性ApoE-/-小鼠予高脂饲料喂养，随机分为5组：香青兰总黄酮低、中、高剂量组分别给予21，42，84 mg·kg-1·d-1灌胃；辛伐他汀组灌服辛伐他汀35 mg·kg-1·d-1；模型组灌服等剂量生理盐水。另设8只相同基因背景和周龄的雄性C57BL/6J小鼠为对照组予普通饲料喂养。各组均灌胃干预12周，采用HE染色观察主动脉病理形态学变化；qRTPCR法检测组织中TGFβ1，Smad2，Smad3，MMP2和MMP9基因的水平。实验结果显示：与模型组比较，HE染色观察TFDM给药组表现主动脉粥样硬化组织损伤明显减轻；TFDM不同剂量组可在一定程度上抑制高脂饲料诱导的ApoE-/-小鼠主动脉TGFβ1，Smad2，Smad3，MMP2，MMP9 mRNA的表达，且呈现一定的剂量依赖关系趋势。提示TFDM具有减缓小鼠动脉粥样硬化形成的作用，其作用机制可能与干预TGFβ1/Smad信号转导有关。

[关键词]动脉粥样硬化； 香青兰总黄酮； TGFβ1/Smad； MMPs

[Abstract]To investigate the effect and mechanism of Dracocephalum moldovica total flavones （TFDM） on the formation of atherosclerosis ApoE-/- mice induced by high fat diet A total of 40 SPF 8weekold male ApoE-/- mice were fed with high fat diet and randomly divided into 5 groups TFDM high， medium， lowdose group were given 21， 42， 84 mg·kg-1·d-1 by gavage； Simvastatin group was fed with simvastatin 35 mg·kg-1·d-1； and model group was given the same dose of normal saline The other eight male C57BL/6J mice of the same genetic background and age were set up as control group and fed with common diet All of the groups were intragastrically intervened for 12 weeks The aortic pathologic changes were observed with HE； qRTPCR was adopted to detect TGFβ1， Smad2， Smad3， MMP2 and MMP9 gene levels in tissues Compared with model group， HE staining in TFDM group showed obvious relief of aortic atherosclerotic tissue injury； each TFDM group showed inhibition in mRNA expressions of TGFβ1， Smad2， Smad3， MMP2 and MMP9 This suggests that TFDM can inhibit atherosclerosis formation， which may be related to the intervention of TGFβ1/Smads signal transduction

[Key words]atherosclerosis； Dracocephalum moldovica total flavones； TGFβ1/Smad； MMPs

動脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种脂质介导的慢性血管炎性病变，是众多心、脑血管疾病发生和发展的重要病理基础，可对人类健康产生严重危害。TGFβ/Smad通路在AS的发生发展过程中发挥着重要的作用，TGFβ具有多种生物学的功能，其对动脉内皮的损伤，血管平滑肌的迁移，动脉壁脂质聚集，细胞外基质的沉积和炎性细胞的浸润等AS的关键步骤均有调节作用[13]。

香青兰Dracocephalum moldovica L，为唇形科青兰属植物，是维吾尔民族药之一，主要用于治疗气管炎、心脏病、高血压等疾患，具有补脑安神、活血化瘀、通路开窍、镇咳止喘等作用[4]。其主要化学成分有黄酮类、挥发油、萜类、氨基酸、微量元素及多肽等，香青兰总黄酮（D moldavuca total flavones，TFDM）为香青兰的主要有效成分，具有降血脂、抑制血小板聚集及保肝、抗炎等作用[57]。本研究应用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠建立AS动物模型，采用HE染色观察TFDM对主动脉斑块面积的干预作用，以及qRTPCR检测小鼠主动脉TGFβ1，Smad2，Smad3，MMP2和MMP9 mRNA的表达探讨TFDM的抗AS作用及其可能机制。

1材料

11动物

SPF级8周龄雄性ApoE-/-小鼠及8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）20120001。

12药物和试剂

香青兰总黄酮（新疆自治区药物研究所，批号20131109）；辛伐他汀片（杭州默沙东制药有限公司，批号L019738）；胆固醇（北京索莱宝科技有限公司，批号108D102）；RNA提取试剂盒、DNA maker I（北京天根生物化科技有限公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo）；qRTPCR试剂盒（QIAGEN）；引物由上海生工公司合成。

13仪器

Mastercycler梯度PCR仪（美国 BioRAD公司）；216K高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；XW80A漩涡混合器VORTER（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；TDZ5WS多管架自动平衡离心机（湘仪离心机仪器有限公司）。

2方法

21动物分组

适应性喂养2周后，将40只SPF级8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为5组，即模型组（给予相应生理盐水）、香青兰总黄酮高剂量组（84 mg·kg-1·d-1）、香青兰总黄酮中剂量组（42 mg·kg-1·d-1）、香青兰总黄酮低剂量组（21 mg·kg-1·d-1）和辛伐他汀阳性对照组（35 mg·kg-1·d-1），每组8只。另设8只相同基因背景和周龄的雄性C57BL/6J正常小鼠为空白对照组。

22模型制备

空白对照组喂养普通饲料，模型组、辛伐他汀组和TFDM组均给予喂养高脂饲料（075%胆固醇、15%猪油、8425%基础饲料），并每日灌胃相应剂量的药物；所有动物自由饮水，连续喂养12周。

23主动脉AS斑块面积的测定

打开小鼠胸腔及腹腔，从主动脉根至腹主动脉末端处分离整条主动脉，4%多聚甲醛固定后在4 ℃冰箱内过夜，次日常规脱水、石蜡包埋并连续切片，切片厚度5 μm制作石蜡切片，HE常规染色后，于光学显微镜下检测主动脉病理形态的变化。

24qRTPCR检测相关基因的表达

241总RNA的提取取-80 ℃冻存的主动脉组织标本置液氮中迅速磨碎，依照天根公司的动物组织总RNA提取试剂盒说明，提取各实验组组织总RNA。紫外分光法确定总RNA的含量和纯度，测定样品260，280 nm处的吸光度A，计算A260/A280及总RNA浓度，选取该比值在18～20的总RNA进行逆转录实验。

242逆转录合成cDNA使用前每个组份轻轻混匀，然后2 000 r·min-1离心20 s；取灭过菌且无酶的02 mL PCR管，依次加入总RNA 1 μL，Oligo（dT）18 primer 1 μL，再加RNaseFree ddH2O至总体积12 μL。将上述混合液用漩涡振荡器混匀，离心后孵育70 ℃ 5 min，然后放在冰上冷却2 min；然后继续往02 mL PCR的管中依次加入RNase抑制剂1 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，dNTPs Mix 2 μL，RT 1 μL，再加双蒸水至总体积20 μL。轻轻混匀后，然后2 000 r·min-1离心20 s；先在42 ℃保温60 min，然后70 ℃变性5 min，然后置于冰上5 min；上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20 ℃保存。

243qRTPCR反应于八联管依次加入：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，QN ROX Relerence Dye 01 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各05 μL，cDNA 1 μL，RNaseFree ddH2O 79 μL，共20 μL，混匀。引物信息见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。qRTPCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，重复40个循环。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。每份样本平行设置4个复孔，另外设立βactin做内参对照，由熔解曲线检测扩增产物的特异性，取其循环阈值（Ct）均值，利用qRTPCR测得的目的基因和参照基因的Ct值。

244计算样本相对表达量将获得的目的基因和参照基因Ct值求平均值后处理，利用相对定量法计算样本相对表达量，处理组目的基因相对于空白组目的基因的量通过公式2ΔΔCt计算得到。

25统计学分析

运用SPSS 200软件，参数值用±s表示，采用OneWay ANOVA方差分析进行统计处理，组间比较采用t检验，P<005表示有显著性差异。

3结果

31香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠主动脉粥样斑块病理变化影响

HE染色结果显示，正常对照组小鼠主動脉的内皮细胞形态完整，动脉中膜平滑肌细胞排列整齐，形态规则，无AS病灶；而模型组和各给药组小鼠均有不同程度的AS病变产生。模型组可见体积较大的斑块形成，斑块内存在大量脂质、泡沫细胞沉积，内膜明显增厚，纤维帽薄、脂质核心较大，斑块突入管腔，导致管腔明显狭窄。辛伐他汀治疗组及香青兰总黄酮治疗组可见内皮细胞尚完整，斑块体积较小，稍隆起，少量脂质与泡沫细胞沉积导致血管内膜局部增厚，无明显管腔狭窄。提示香青兰总黄酮对主动脉粥样硬化斑块有一定的稳定作用，见图1。统计结果显示，给药组和模型组小鼠主动脉斑块面积、管腔面积均无显著性差异，香青兰总黄酮高、中剂量组及辛伐他汀阳性药物组斑块面积与管腔面积比低于模型组，且差异具有显著性（P<005），提示香青兰总黄酮可明显减少动脉粥样硬化斑块面积，见表2。

32香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠主动脉TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA表达水平的影响

随着TFDM药物剂量增加，TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA表达下调。与正常组相比，模型组主动脉组织中的TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA的含量表达明显升高，具有显著性差异（P<005）。与模型组相比，TFDM各剂量组与辛伐他丁组对TGF

33香青兰总黄酮对ApoE-/-小鼠主动脉MMP2，MMP9的mRNA表达水平的影响

随着TFDM药物剂量增加，MMP2，MMP9 mRNA表达下调。与正常组相比，模型组MMP2，MMP9 mRNA的含量明显升高，具有显著性差异（P<005）。与模型组相比，辛伐他汀组和TFDM各剂量组对MMP2，MMP9 mRNA的表达呈剂量依赖性降低（P<005，P<001），见图3。

4讨论

AS是一种累及全身大、中动脉内膜的慢性炎症性疾病，目前认为，动脉粥样硬化是由单核/淋巴细胞黏附并激活内皮细胞而开启的由多种原因导致的疾病。随着研究的深入，发现介导细胞因子活性的信号通路在AS的发生、发展中有重要作用。对这些细胞因子及信号通路的广泛研究将有助于寻找新的抗AS药物，并进一步从分子水平研究药物抗AS的作用机制[89]。

本实验研究中选用的ApoE-/-小鼠，是目前公认的进行药物抗动脉粥样硬化活性筛选及作用机制的最经典的动物模型之一[10]，而C57BL/6J小鼠与其具有相同的遗传背景，在研究中常作为正常组。ApoE-/-小鼠在正常饮食及高脂饮食情况下血脂均会升高，且其发病机制与人类动脉粥样硬化形成过程相似。已有研究报告[1112]，ApoE-/-小鼠在5～6周龄时主要是单核细胞趋附于损伤的内皮细胞处，8～10周龄出现脂纹，15～20周龄后逐渐出现纤维斑块，病变部位以主动脉根最为明显，其次为胸主动脉。本实验中持续给予ApoE-/-小鼠高脂饲料喂12周即18周龄，HE染色可见模型组小鼠动脉发生动脉粥样硬化斑块沉积，TFDM组的病理改变程度均轻于模型组。

在动脉粥样硬化的发生发展过程中，TGFβ/Smad通路具有双向调节的作用。大量研究表明TGFβ对血管平滑肌细胞增殖、迁移及分化具有调节作用。在正常生理水平下，TGFβ具有抑制血管平滑肌的增生的作用[13]。但在炎症以及损伤的病理状态下，由于Smad3表达增加和MAPK途径的激活，TGFβ具有促进血管平滑肌细胞增生，促纤维化的作用，从而促使内膜增生[1415]。实验结果表明：在动脉粥样硬化进程中，与正常组相比，模型组主动脉组织中的TGFβ1，Smad2，Smad3 mRNA的表达水平明显升高，具有显著性差异。与模型组相比，TFDM剂量组对mRNA的含量呈剂量依赖性降低（P<005）。提示TFDM可能通过下调TGFβ1和Smad2/3 mRNA的表达，抑制Smad2/3的核转位，从而阻断TGFβ1的信号转导，抑制平滑肌细胞增生。

基质金属蛋白酶（MMPs）是一组同源的酶活性Zn2+和Ca2+依赖性的中性蛋白酶家族，其主要的生物学功能是特异性的与细胞外基质（ECM）各成分相结合，参与ECM的降解及重构，维持ECM的动态平衡，ECM不仅是血管壁的主要成分，也是影响粥样斑块纤维帽厚度和完整性，以及斑块稳定性的重要因素[1617]。有研究表明，正常人和鼠的动脉血管VSMC均表达MMP9，但其活性在无损伤血管中检测不到而损伤部位活化MMP9的表达明显上调，并通过降解细胞外基质，促进血管平滑肌增殖和迁移，在动脉粥样硬化的发生、发展和斑块破裂的过程中发挥重要[18]。实验结果显示：与空白组比较，模型组MMP2，MMP9 mRNA的表达明显较强，但TFDM各给药组及辛伐他汀阳性药物组能降低MMP2，MMP9 mRNA的表达，从而减少ECM降解，减轻血管重构；同时可以抑制损伤处的纤维帽变薄，从而降低了斑块破裂的危险，增加了斑块稳定性。

综上所述，香青兰总黄酮很有可能通过作用于TGFβ1/Smad信号转导途径，下调Smad2/3的表达，以及抑制MMP2和MMP9的表达，从而抑制平滑肌细胞的活化与增殖，增加斑块的稳定性，延缓了AS的病理进程。信号转导与疾病发生的关系是当今科学研究的热点课题，更深层次上探讨疾病发生的分子机制，通过干预信号转导通路来防治疾病将会有良好的应用前景，TGFβ1/Smad信号通道有望成为动脉粥样硬化药物研究干预靶点，并在动脉粥样硬化以及相关心血管疾病的治疗中发挥其重要作用[19]。

[参考文献]

[1]黄江伟，刘厂辉转化生长因子β在动脉粥样硬化中作用的研究进展[J]中国医药指南， 2013（6）：58

[2]张建平，严士海二苯乙烯苷抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的机理研究[J]中华中医药学刊，2015，33（9）：2086

[3]李娜，张新庄，王俨如，等基于网络药理学方法探讨通塞脉片治疗动脉粥样硬化的作用机制[J]中国中药杂志，2016，41（9）：1706

[4]袁勇，邢建国，王立萍，等香青蘭总黄酮在大鼠体内的药代动力学研究[J]石河子大学学报：自然科学版，2014，32（1）：69

[5]Jiang J，Yuan X，Wang T， et al Antioxidative and cardioprotective effects of total flavonoids extracted from Dracocephalum moldavica Lagainst acute ischemia/reperfusioninduced myocardial injury in isolated rat heart[J] Cardiovasc Toxicol，2014，14（1）：74

[6]曹文疆，彭克军，袁勇，等香青兰总黄酮抗大鼠动脉粥样硬化作用的初步研究[J]中国医院药学杂志，2013，33（19）：1570

[7]樊鑫梅，曹文疆，邢建国，等香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究[J]中成药，2013，35（8）：1625

[8]卢琼，谭睿，崔文婷，等细胞信号通路与动脉粥样硬化[J]中国医药生物科技，2012，7（3）： 211

[9]彭毅，邵紫韫，丁世芳动脉粥样硬化中的细胞因子及细胞因子相关信号通路[J]中国动脉硬化杂志，2008，16（2）：161

[10]von Holt K， Lebrun S， Stinn W， et al Progression of atherosclerosis in the ApoE-/-model： 12month exposureto cigarette mainstream smoke combined with highcholesterol/fat diet[J] Atherosclerosis，2015，205（1）：135.

[11]徐芳，刘颖，齐洁阿托伐他汀对ApoE基因敲除小鼠血管外膜成纤维细胞表型的影响[J]中国生理病理杂志，2016，32（9）：1599

[12]祝娉婷，孙云，刘兆国半枝莲总黄酮对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化及磷脂转运蛋白表达的影响[J]中国药理学通报，2015，31（6）：833

[13]黄江伟，刘厂辉生长因子β在动脉粥样硬化中作用的研究进展[J]中国医药指南， 2013（6）： 58

[14]Suwanabol P A， Seedial S M， Shi X， et al TGFβ increases vascular smooth muscle cell proliferation through the Smad3 and ERK MAPK pathways[J] J Vasc Surg， 2012， 56（2）： 446

[15]Ren M， Wang B， Zhang J， et al Smad2 and Smad3 as mediators of the response of adventitial fibroblasts induced by transforming growth factorβ1[J] Mol Med Rep， 2011， 4（3）： 561

[16]Chen Y F， Tsai H Y， Wu K J， et al Pipoxolan ameliorates cerebral ischemia via inhibition of neuronal apoptosis and intimal hyperplasia through attenuation of VSMC migration and modulation of matrix metalloproteinase2/9 and Ras/MEK/ERK signaling pathways[J] PLoS ONE， 2013，8（9）：e75654

[17]Dilme J F， Bellmunt S， Camacho M， et alInfluence of cardiovascular risk factors on levels of matrix metalloproteinases 2 and 9 in human abdominal aortic aneurysms[J] Eur J Vasc Endovasc Surq，2014，48（4）：374

[18]Ni S W， Wang X F， Tang Z C Correlations between MMP2/MMP9 promoter polymorphisms and ischemic stroke [J] Int J Clin Exp Med， 2014， 7（2）： 400

[19]王文東转化生长因子R/Smad3信号通路与动脉粥样硬化[J]中国动脉硬化杂志，2011， 19（10）：875

[责任编辑张宁宁]