基于LCQTOFMS/MS技术分析不同产地杜仲的差异化学成分

严颖　赵慧　邹立思　刘训红　柴川　王胜男　华愉教

[摘要]为了探讨生态环境对杜仲代谢物合成积累的影响，本文采用液相色谱串联三重四级杆飞行时间高分辨质谱（LCQTOF MS/MS）结合多元统计分析技术对不同产地杜仲中化学成分差异性进行研究。通过二级串联质谱分析，对其质谱数据进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等，并进行特征峰提取；用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLSDA）进行数据处理；根据一级质谱精确质荷比和二级质谱碎片信息，结合软件数据库搜索、标准品比对及相关文献进行成分鉴定。结果显示，3个不同产地杜仲样品间的化学组成得到有效区分；初步鉴定出23个差异化学成分，其中14种共有差异化学成分呈现不同的变化规律。该结果为揭示生态环境对杜仲代谢物合成积累的影响规律提供基础资料。

[关键词]杜仲； 液相色谱串联三重四极杆飞行时间高分辨质谱； 产地； 化学成分

[Abstract]In order to study the influence of ecological environment regarding the synthesis and accumulation of metabolites in Eucommiae Cortex， LCQTOF MS/MS method combined with multivariate statistical analysis was used to analyze the differences of chemical constituents in Eucommiae Cortex from different habitats Through the analysis of the multistage tandem mass spectrometry， the characteristic peaks were extracted with mass spectrometry data peak matching， peak alignment， and noise filtering Principal component analysis （PCA） and partial leastsquares discriminant analysis （PLSDA） were used for data processing The chemical constituents were identified or tentative presumed according to MS accurate mass and MS/MS spectrometry fragmentation information， combined with the software of database search， comparison with reference standards and literature The results show the differences among samples of Eucommiae Cortex from different habitats are distinguishable A total of 23 chemical constituents in Eucommiae Cortex were identified or tentative presumed Among of them， 14 kinds of common differential chemical constituents （aucubin， geniposidic acid， neochlorogenic acid， syringin， olivil4′，4′diOβDglucopyranoside， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， 1hydroxypinoresinol 4′，4′diOβDglucopyranoside， caffeic acid， pinoresinoldiOβDglucopyranoside， syringaresionldiOβDglucopyranoside， pinoresinol4′OβDglucopyranoside， eucommiol， isochlorogenic acid C and asiatic acid） presented different changing laws This study provides basic information for revealing the influence law of ecological environment on the biosynthesis of metabolites in Eucommiae Cortex

[Key words]Eucommiae Cortex； LCQTOF MS/MS； habitats； chemical constituents

杜仲為我国特有的名贵药材，药用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品，来源于杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oilv的干燥树皮，具有补肝肾、强筋骨、安胎之功效，用于肝肾不足，腰膝酸痛，筋骨无力，头晕目眩，妊娠漏血，胎动不安等症[1]。现代研究表明，杜仲含有木脂素类、环烯醚萜类、苯丙素类、多糖等多类药效活性成分，具有降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗菌抗病毒、保肝护肾、抗骨质疏松等多方面药理作用[23]。杜仲属落叶乔木，在我国主要分布在秦岭以南华中地区的四川、贵州、湖南、湖北、陕西等省。近年来我国杜仲引种栽培，资源不断扩大，市售杜仲药材主要为栽培品。由于杜仲植物地理分布广，形体变化大，药材品质差异大，药材质量参差不齐，难以实现商品药材标准化[4]。目前对杜仲药材的研究主要集中于化学成分、药理作用和品质评价方面，对于不同产地杜仲药材的研究主要集中于主要成分含量变化，亦有指纹图谱研究，紫外谱线组鉴别等[57]，运用植物代谢组学技术分析不同产地杜仲中化学成分差异的研究还很少。

植物代谢组学技术是对植物提取物中代谢组进行高通量、无偏差全面分析的技术，特别适合于中药中多组分复杂体系的分析[8]，使中药研究更符合祖国医学的整体观念。本实验借鉴植物代谢组学的研究思路和方法，采用液相色谱串联三重四极杆飞行时间高分辨质谱（LCQTOF MS/MS）技术分析不同产地杜仲化学成分的差异性，并通过多元统计分析找出差异显著的化学成分及其变化规律，为揭示生态环境对杜仲代谢产物合成积累的影响规律及探讨杜仲药材的品质形成机制提供基础资料。

1材料

QTOFTM 5600 SystemMS/MS电喷雾飞行时间高分辨质谱仪（配备Peakview 12数据处理工作站，美国Sciex公司）；SIL20A XR超快速液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；Anke TGL16B离心机（上海安亭科学仪器有限公司）；BSA224S 电子天平（德国赛多利斯公司）；KQ500B型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；MilliQ超纯水制备仪（美国Millipore公司）。

乙腈、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；甲醇（批号143135，色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；实验用水由MilliQ纯水器制备的超纯水。

杜仲样品分别于2016年5月实地采集于贵州湄潭、湖北利川和陕西宁强，每个产地5份样品，经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为杜仲科植物杜仲E ulmoides的干燥树皮。留样凭证保存于南京中医药大学中药鉴定实验室。

2方法与结果

21供试品溶液的制备

精密称取样品粉末06 g，精密加入50%甲醇30 mL，密闭，称定质量，超声处理（功率250 W，频率30 kHz）20 min，放置冷却，再次称定质量，用50%甲醇补足质量损失，过滤，滤液以12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过022 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

22实验条件

221色谱条件色谱柱Agilent ZORBAX SBC18柱（46 mm ×250 mm，5 μm）；流动相A为01%甲酸水溶液，B为乙腈， 梯度洗脱， 洗脱程序为 0～10 min， 5%～10% B，10～12 min， 10%～15% B，12～22 min， 15%～20% B，22～35 min， 20%～30% B，35～42 min，30%～60% B，42～55 min，60%～85% B，55～57 min，85%～5% B，57～60 min，5%B；柱温30 ℃；流速10 mL·min-1；进样量10 μL。

222质谱条件电喷雾离子源（ESI）负离子模式；质量扫描范围m/z 50 ～ 1 500；气帘气压力（CUR）为2758 kPa；雾化气压力（GS1）为3792 kPa；辅助气压力（GS2）为3792 kPa；离子源温度（TEM）为550 ℃；喷雾电压（IS）为-4 500 V；脱簇电压（DP）为-100 V。

23样品处理方法的选择

供试品溶液的制备中分别考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3种溶剂，结果表明50%甲醇为溶剂的色谱峰峰形优于其他2种溶剂。又考察超声提取10，20，40，60 min，结果表明超声提取20 min相对峰面积较大。

24色谱条件的优选

流动相的选择分别考察了甲醇水、乙腈水、甲醇01%甲酸水、乙腈01%甲酸水及梯度洗脱条件下对样品中各峰分离度的影响，结果发现，采用乙腈01%甲酸水溶液梯度洗脱时，峰型较好且有良好的分离效果。最终确定了最佳的色谱条件。

25样品分析

根据设定的液相色谱质谱条件，取供试品溶液进样分析。不同产地杜仲样品在负离子模式下的LCQTOF MS/MS基峰强度离子流（BPI）色谱图，见图1。

26多元统计分析

将原始质谱数据和色谱图导入Peakview 12进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等，结果导入SIMCAP 130进行分析。采用主成分分析（PCA），通过初步观察各样品的聚集情况，直观地表达不同产地杜仲的化学组成差异；随后以偏最小二乘辨别分析（PLSDA）分别对各样品进行分类，其中R2X，R2Y越接近1表示模型越稳定，Q2 >05表示预测率高。根据PLSDA模型得到的变量权重值（VIP >1）找到潜在的差异化学成分。采用t检验，验证多维统计中找到的差异化学成分是否在单维统计中具有显著性差异，其中P<005有显著性差异。

261PCA分析主成分分析也称为主分量分析，旨在利用降维的思路将原来变量重新组合成一组新的互相无关的几个綜合变量，同时根据实际情况从中选取几个较少的综合变量，尽可能多的反映原来变量信息的统计方法。采用PCA多变量模式识别方法对3个产地杜仲样品进行降维分析。3个产地杜仲PCA分析的散点图（t[1]：680%；t[2]：239%），见图2，可以看出，3个产地杜仲样品分布在不同区域，分类结果较为理想，说明3个产地的杜仲样品的化学成分存在明显差异。

262PLSDA分析PLSDA分析是一种有监督的模式识别方法，本文中用于确定不同产地杜仲之间的差异变量，即差异化学成分。常用变量载荷评价参数（VIP）值用于描述变量的贡献程度，一般认为当VIP >1时，该变量是重要的。首先对贵州湄潭和湖北利川2个产地的杜仲样品进行PLSDA分析，在散点图中2个产地的样品可以明显的分开，见图3a。模型验证结果（R2Y=0999，Q2=0999）显示其有效可靠。与无监督模式的主成分分析（PCA）相比较，2个产地的杜仲样品得到更大程度的分离，且有助于寻找差异的化学成分。VIP的得分图见图3b显示，对2组分类贡献较大的差异性成分（VIP>1）的共有114个特征峰。

对贵州湄潭和陕西宁强2个产地的杜仲样品进行PLSDA分析，2个产地的样品区分明显，见图4a。模型验证结果（R2Y=0999，Q2=0999）证明其可靠程度较高。根据VIP得分图，见图4b，所示对2组分类贡献较大的差异性成分（VIP>1），得到99个特征峰。

对湖北利川和陕西宁强的杜仲样品进行PLSDA分析，在其散点图中两者可以明显得到区分，见图5a。模型验证显示其有效可靠（R2Y=0999，Q2=0998），同样对VIP得分图，见图5b，进行考察，得到119个特征峰。

27差异化学成分的鉴定

通过一级质谱确定精确相对分子质量，二级质谱获得裂解信息，结合HMDB（http： //www hmdb ca/）和METLIN（http： //metlin Scripps edu /）数据库搜索、对照品比对及已报道文献[922]对VIP>1且P<005的差异化学成分进行结构鉴定，初步鉴定出23个化学成分，结果见表1。

28共有差异化学成分的相对含量变化

所分析的3个不同产地杜仲样品中共有14个为共有差异化学成分，提取各共有差异成分在各组样品间对应的峰面积代表其相对含量，对不同产地杜仲样品间同一物质峰面积的平均值标准差进行计算，得到共有差异成分在不同产地杜仲间的相对含量变化，见图6。其中除咖啡酸和松脂醇单葡萄糖苷含量以陕西宁强产的较高，积雪草酸以湖北利川产较高外，桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、新绿原酸、橄榄素二葡萄糖苷、绿原酸、隐绿原酸、1羟基松脂素二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、杜仲醇和异绿原酸C均以贵州湄潭产的含量较高。

3讨论

建立了基于LCQTOF MS/MS结合多元统计分析技术的不同产地杜仲化学成分差异的分析方法，并从样品制备、色谱图分析、数据处理等方面进行探讨。PCA分析结果显示不同产地杜仲样品在PCA轴上呈逐步变化的趋势，可以看出3个产地杜仲样

品分布在不同区域，分类结果较为理想，说明3个产地的杜仲样品的化学成分存在明显差异。所鉴定的3个不同产地杜仲样品中的23个差异化学成分中有14个为共有差异化学成分，分别为：桃叶珊瑚苷、

京尼平苷酸、新绿原酸、橄榄素二葡萄糖苷、绿原酸、隐绿原酸、1羟基松脂素二葡萄糖苷、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、松脂素单葡萄糖苷、杜仲醇、异绿原酸C和积雪草酸。其中，松脂醇二葡萄糖苷为2015年版《中国药典》中杜仲的含量测定质量评价指标，松脂醇二葡萄糖苷相对含量以贵州湄潭产的较高，其他共有差异化学成分，除咖啡酸和松脂素单葡萄糖苷含量以陕西宁强产的较高，积雪草酸以湖北利川产较高外，均以贵州湄潭产的含量较高。该实验结果可为揭示生态环境对杜仲代谢产物合成积累的影响规律以及探讨杜仲药材的品质形成机制提供基础资料。

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[責任编辑丁广治]