苯乙醇苷类化合物与ctDNA的相互作用

袁欢　王涛　祝晨蔯　吴爱芝　林朝展

[摘要]以中性红为分子探针研究2种苯乙醇苷类化合物（PhGs）毛蕊花糖苷和连翘酯苷B在生理条件下与小牛胸腺DNA（ctDNA）之间的相互作用。荧光光谱、紫外光谱、黏度、DNA热变性实验和分子对接结果表明：这2种PhGs主要采用氢键作用以沟区方式结合到ctDNA双螺旋小沟中，毛蕊花糖苷与DNA结合作用更强。

[关键词]苯乙醇苷； ctDNA； 中性红； 分子对接

[Abstract]In physiological condition， the interaction of acteoside and forsythoside B with calf thymus DNA using neutral red （NR） as a fluorescence probe were investigated by fluorescence， UVvisible spectrophotometry， viscosity， DNA melting techniques， and molecular docking It is observed that acteoside and forsythoside B can react with DNA The major mode of recognition between drug and DNA is groove binding by hydrogen bonds， and the interaction of acteoside with DNA is stronger than that of forsythoside B

[Key words]phenylethanoid glycosides； ctDNA； neutral red； molecular docking

眾所周知，脱氧核糖核酸（DNA）是生命体内基因表达的重要物质基础。研究药物小分子与DNA之间的相互作用机理，是当今生命科学领域共同关注的课题。查阅文献发现，糖苷药物中的糖基作为药物分子的一部分不仅可以调节脂水分配系数、调节血浆半衰期、改善药动学性能，而且其糖基片段上丰富的羟基对DNA等作用靶点具有特异性的识别与结合功能，因此糖基作为直接功能基团可以存在于许多以DNA为靶点的抗肿瘤化疗药物中[1]。含双糖和三糖的苯乙醇苷类成分（PhGs） 毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B在紫珠属植物Callicarpa L中广泛存在，药理实验显示这2个化合物具有良好的抗癌和抗炎活性[23]。PhGs抑制恶性细胞增生的能力主要取决于苯乙基上的取代基，表现为3，4邻二羟基苯乙基芳香体系有相当强的抗肿瘤作用[4]。毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B中正含有这样的结构片断，因此研究二者与DNA的微观相互作用具有重要意义。

DNA本身荧光极弱，常用溴化乙锭作为荧光探针，但其毒性大，具有强致癌性，污染环境。与溴化乙锭相比，中性红（NR）作为荧光探针稳定性好、毒性低[5]。本文将以NR为分子探针，选择紫珠属植物中富含的2个PhGs成分毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B作为药物小分子，结构见图1，采用光谱法和分子对接技术首次研究其与ctDNA的相互作用，旨在阐明PhGs与DNA的作用方式、糖基片段对作用方式的影响。实验结果为以DNA为靶标的药物分子设计提供有益探索，同时也为紫珠属植物的深入临床医学研究提供重要理论依据。

1材料

F2500荧光光度计（Hitachi公司），UV1000紫外可见光谱仪（上海天美科学仪器有限公司），CHIRASCAN圆二色光谱仪（英国应用光物理公司），VG ZABHS质谱仪（英国VG公司），AVANCE400超导核磁共振仪（瑞士Bruker公司），伍氏黏度计。

毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B（从紫珠属植物藤紫珠中分离得到，纯度>98%）溶液：配制成浓度为128×10-3mol·L-1的水溶液。中性红（上海阿拉丁，纯度99%）溶液：配制成100×10-5mol·L-1的水溶液。DNA（华美生物工程），溶液浓度以A260 nm/A280 nm>18衡量，浓度以260 nm处吸光度来确定（ε=6 600 L·mol-1·cm-1），4 ℃以下避光保存。缓冲液由01 mol·L-1Tris溶液和01 mol·L-1HCl配制（pH 740），实验过程中所用试剂均为分析纯，用水为二次蒸馏水。

2方法

21紫外测试在5 mL量瓶中，加入1 mL的trisHCl缓冲溶液和50μL的药物溶液，分别在容量瓶中依次加入不同体积的DNA溶液，trisHCl溶液定容。室温放置20 min后，以缓冲液为参比，测定200～400 nm紫外图谱。间隔05 nm，狭缝2 nm。

22荧光试验分别移取浓度为100×10-3 mol·L-1的DNA溶液50 μL，浓度为100×10-3 mol·L-1的NR溶液50 μL于4 mL石英吸收池中，加入缓冲液TrisHCl 3 mL，用微量注射器进行荧光滴定，每次加入10 μL药物溶液，混合均匀，静置5 min。以467 nm为激发波长，入射和发射狭缝分别为5 nm，在荧光光度计上记录500～700 nm波长的发射光谱。

23DNA熔点试验配制2组NRDNA溶液，其中1组加入适量药物，水浴加热，在40～100 ℃，每隔5 ℃监测DNA在260 nm处吸光值的变化。以fss=（A-A0）/（Af -A0）为纵坐标（A，Af 分别为起始吸光度和最终吸光度，A为表观吸光度），温度为横坐标作图，得到DNA的热变性温度曲线图。

24黏度试验DNA浓度固定为440 ×10-4 mol·L-1，药物浓度依次增大，温度恒定在（25±01） ℃，反应20 min后，进行测量。数据以（η/η0）1/3对药物浓度作图。η代表DNA在药物体系时的黏度，η0代表DNA单独存在时的黏度。

25分子对接药物小分子初始结构由分子模拟软件SybylX13 获得，运用Tripos力场和GasteigerHückel电荷对分子结构进行优化。DNA晶体结构来自PDB蛋白质数据库（编号425D）。采用Surflex程序进行分子對接时，考虑了小分子10个构象，结合自由能最低的构象用来做进一步理论分析。dsDNA分子优化前去除其结构中的水分子。对接原型分子通过选择碱基对生成，对接过程中考虑了配体小分子环的柔性。

3结果与讨论

31紫外光谱NR与DNA相互作用的紫外可见光谱图，见图2，显示了DNA的加入对NR吸收光谱的影响。图2中曲线 （a）是NR的吸收谱图，可以看出其最大吸收峰在462 nm，DNA的加入使得NR在462 nm处的吸收峰发生了明显减色效应和一定程度的红移现象，说明NR与DNA发生了嵌插作用[6]。545 nm处附近出现了1个新吸收峰，此峰应该是NRDNA复合物的吸收峰[7]。462 nm处明显的减色效应表明NR和DNA碱基之间紧密靠近，DNA中大量碱基层层堆积，使得双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区。红移现象表明NR嵌入到DNA碱基对后，周围所处的环境发生了改变，DNA与溶剂水分子形成氢键的能力降低。结果表明，NR主要以嵌插方式与DNA结合形成复合物。

毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B与DNA相互作用的紫外可见吸收光谱，见图3。这2个PhGs由于丙烯酸酯双键与苯环共扼振动发生在333 nm附近，因而这类成分在333 nm附近具有特定的吸收光谱。与DNANR体系的吸收图谱比较，见图2。当PhGs溶液中不断增加DNA浓度时，这类小分子在333 nm处的最大吸收峰强度几乎没有发生红移和减色效应，表明这2个小分子与DNA的作用方式不是典型

32药物对NRDNA体系荧光猝灭程度的影响NR在pH 740水溶液中荧光很弱，当有DNA存在时，NR在DNA中的嵌插式结合会使体系荧光强度明显增强。2种PhGs逐渐加入到NRDNA体系时的荧光猝灭曲线，其中F0为不加药物时在602 nm处的荧光强度，F为药物存在时在602 nm处的荧光强度，见图4。荧光光谱显示随着PhGs加入到NRDNA体系，荧光峰的形状和位置并没有改变，但其荧光强度随着药物浓度的增加而不断降低，并且2个PhGs化合物对NRDNA体系荧光猝灭的程度存在明显差异，猝灭程度毛蕊花糖苷明显大于连翘酯苷 B，表明PhGs与NR之间存在竞争结合，间接反映了毛蕊花糖苷与DNA的结合强度大于连翘酯苷B。荧光猝灭的原因可能是富含羟基的PhGs参与了和NR竞争结合DNA的过程，使得NR和DNA结合力减弱，从而导致体系荧光强度降低，推测氢键作用对PhGs和DNA的结合具有重要影响[9]。

33药物对NRDNA热变性温度的影响通常把DNA双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔接温度，用Tm表示，药物与DNA的相互作用会影响Tm。嵌插作用能够使双螺旋结构更加稳定，因而会使Tm增加5～8 ℃，而沟区结合不会使Tm有明显增加[10]。当fss=05时所对应的温度就是Tm，当药物加入到DNANR后，体系Tm减小，再次证明药物与DNA的结合不是嵌插式结合，Tm的降低可能是由于药物与DNA沟区的结合作用，一定程度上改变了体系的构象，使体系稳定性降低，见图5。

34黏度试验黏度测定一般被认为是确定键合模式最有力的证据之一。当药物以嵌插方式进入DNA双螺旋碱基对时，相邻碱基对之间的距离会增大以便容纳插入的配体，导致DNA双螺旋结构膨胀变粗变长，DNA溶液的黏度会增大；而以沟区结合等非嵌插方式与DNA作用时，DNA 结构不会伸展，此时DNA 溶液的黏度无明显变化[11]。DNA在不同浓度药物存在时的相对黏度变化见图 6。结果显示，加入药物后，DNA的相对黏度变化并未明显增加，表明药物与DNA的作用未引起DNA双螺旋骨架的扭曲变化，推测其与DNA作用方式为沟区结合。

35分子对接利用分子对接技术可以直观形象的反映药物与DNA 的结合情况，这有助于从理论上确定小分子与DNA相互作用的机制和模式[1214]。结合毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B与DNA相互作用的实验结果可知，毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B主要以沟区方式与DNA结合。因此分子对接过程中选择DNA分子的双螺旋小沟作为PhGs结合靶点，2个小分子与DNA作用的最佳分子对接模型，见图7。药物与DNA相互作用过程中根据分子对接分值（total score）值计算得到的结合常数Ka和ΔG，见表1。

对接结果显示，毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B可以紧密结合在ctDNA的GGTAC小沟区域，形成双螺旋d（GGTACCCATG）2DNA复合物。2个PhGs中的苯乙基、咖啡酰基和糖环上的羟基可与DNA上的胸腺嘧啶、腺嘌呤、戊糖、磷酸之间生成多个氢键，即PhGs与DNA二者之间存在强的氢键相互作用，这些氢键的存在对于PhGs结合在DNA小沟区域起着至关重要的作用。毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B与DNA结合时的total score值分别为753和711，结合常数Ka分别为339×107和129×107，结合吉布斯自由能变化值ΔG分别为-4299，-4059 kJ·mol-1，计算结果表明毛蕊花糖苷与DNA的结合能力大于连翘酯苷 B，结论与实验结果吻合。毛蕊花糖苷中主要是苯乙基、葡萄糖基和咖啡酰基结合于DNA小沟，鼠李糖暴露在DNA链外；而连翘酯苷 B中主要是苯乙基、葡萄糖基和芹糖结合于DNA小沟，咖啡酰基和鼠李糖暴露在DNA链外，表明PhGs中心葡萄糖6位被芹糖取代后的角度更有利于小分子与DNA双螺旋小沟匹配，见图7，。原因可能是小分子中的这些多元环由扭转的自由键连接，由此可产生合适的扭转力来匹配小沟区的螺旋曲线，并在DNA双螺旋链中AT富集的小沟区边缘主要通过氢键作用形成接触。这种选择性作用可以非嵌入性地捆缚住DNA，阻止DNA的模板作用，从而达到抗肿瘤、抗病毒的目的。

4结语

本文用光谱学方法和分子对接技术探讨了生理条件下PhGs类成分毛蕊花糖苷和连翘酯苷 B分别与DNA的相互作用。结果表明：结构类似的PhGs由于糖基种类、数目和取代位置的不同导致了与DNA结合模式的差异，这对于从分子水平深入理解PhGs化合物与DNA的作用机制，以及如何修饰一系列结构类似的PhGs药物促进其在体内吸收和转运具有极为重要的意义。另外，探究结构不同的PhGs与DNA之间可能的序列选择性为PhGs可不同程度修复损伤的DNA提供了合理解释。

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[責任编辑丁广治]