猪源大肠埃希菌氯霉素类抗生素主要耐药基因的检测与分析

赵凤菊，关 淼，李清竹，李井春，梁 乔，顾贵波

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164)



猪源大肠埃希菌氯霉素类抗生素主要耐药基因的检测与分析

赵凤菊，关 淼，李清竹，李井春，梁 乔，顾贵波

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164)

为查明辽宁地区猪源大肠埃希菌氯霉素类耐药菌株主要耐药基因的流行及分布情况，为猪大肠埃希菌病的防控提供科学依据，采用聚合酶链反应(PCR)对25株氯霉素类耐药菌株进行cat1、cmlA基因检测，并对cat1和cmlA基因进行序列分析。通过对耐药基因的检测发现，cat1、cmlA基因的检出率分别为32%和84%，8株同时检出cat1和cmlA基因。因此，在辽宁地区cmlA基因在猪源大肠埃希菌耐药菌株中普遍存在，cmlA介导的泵出机制是辽宁地区氯霉素类抗生素产生耐药性的主要原因；其次为cat1基因，与氯霉素乙酰转移酶的灭活有关。

大肠埃希菌；氯霉素类抗生素；耐药基因；聚合酶链反应；猪

大肠埃希菌是人类和动物肠道正常菌群的主要成员，也是一种常见的人畜共患病病原，具有携带抗性质粒和转移抗性的能力，在抗生素耐药细菌种群的生态环境中起着重要的作用，严重威胁着人类和动物健康[1]。氯霉素类药物包括氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，是一种广谱抗生素，吸收快、体内分布广泛，在兽医临床上发挥着重要的作用，特别对大肠埃希菌和沙门菌等革兰阴性菌有较强的抑菌作用[2]。但由于氯霉素和甲岚霉素可以抑制哺乳动物线粒体蛋白质的合成，因此，包括中国在内的许多国家陆续禁止了它们在兽医临床上的使用[3-4]。而氟苯尼考因安全性和有效性在我国兽医临床上仍被广泛使用，由于抗生素的不合理使用导致细菌耐药性，尤其是多重耐药现象越来越严重。抗生素的耐药性破坏了有效治疗人类和动物细菌性疾病的可能性，同时使用抗生素产生的选择压力有利于耐药细菌的传播，是未来的全球性主要威胁之一[5]。

在对辽宁地区猪源大肠埃希菌的耐药性调查时，发现猪源大肠埃希菌对氯霉素类药物的耐药率高达38.47%(25/65)。为了解氯霉素类耐药基因cat1、cmlA在辽宁地区猪源大肠埃希菌中的流行和分布特点，对25株氯霉素类抗生素耐药的菌株进行PCR检测，为兽医临床氯霉素类抗生素的合理使用及猪大肠埃希菌病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 25株对氯霉素类抗生素耐药的猪源大肠埃希菌，由辽宁不同地区病死猪或患病猪的组织脏器、活猪粪便中分离得到，由辽宁省动物疫病预防控制中心实验室鉴定并保存。

1.1.2 培养基及试剂 营养琼脂培养基、麦康凯培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品，生产批号分别为20130608、20130708；水解酪蛋白琼脂培养基(MH)、药敏纸片,杭州市天及微生物试剂有限公司产品，生产批号分别为140506、140506；DNAzol提取试剂,Invitrogen产品；PrimeSTAR®HS DNA Polymerase with GD buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×Ex-Taqbuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DNA Marker DL 2 000、溴化乙锭,宝生物工程(大连)有限公司产品；其他为实验室常规试剂。

1.1.3 PCR扩增引物 根据GenBank上登录的cat1、cmlA基因序列，利用Primer Premier5.0软件设计并合成了两对特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA模板的制备 挑取18 h～24 h培养的培养物，用1 mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。吸取200 μL菌悬液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取试剂，混匀后4℃、12 000 r/min离心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL无水乙醇，混匀后4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清，无菌水配制的750 mL/L乙醇洗涤2次，干燥后用40 μL无菌水溶解沉淀，置-20℃保存备用。

表1 引物序列

1.2.2 耐药基因检测体系 采用25 μL反应体系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，灭菌水16.375 μL，模板 2 μL。

1.2.3 基因测序检测体系 采用50 μL反应体系，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×Prime STAR GD buffer(Mg2+plus)25 μL， dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物各1 μL(引物浓度为20 μmol/L)，模板5 μL，灭菌水补至50 μL。

1.2.4 PCR反应条件 94℃ 5 min；94℃ 45 s，退火温度(根据引物选择合适退火温度) 45 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。

1.2.5 扩增产物的序列测定 选取5株cat1基因阳性样品和16株cmlA基因阳性样品，将其PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，并与NCBI基因库进行序列同源性比较。

2 结果

2.1 耐药基因检测结果

利用PCR检测方法，通过对25株氯霉素类耐药菌株进行主要耐药基因的检测(表2)。结果表明，25株氯霉素类耐药菌株中有4株未检出，cat1、cmlA基因的检出率分别为32%、84%；其中13株检出cmlA基因，检出率为52%，8株同时检出cat1、cmlA基因，检出率为32%。两种耐药基因在辽宁不同地区的分布存在差异，其中cmlA基因在辽宁5个不同地区的耐药菌株中均有检出，由此可见，cmlA基因在辽宁不同地区的耐药菌株中普遍存在；同时cat1、cmlA两种基因在除辽东以外其他地区的耐药菌株中均有检出，以辽西地区检出率最高(表3)。

表2 25株大肠埃希菌中氯霉素类抗生素主要耐药基因的分布

表3 不同地区大肠埃希菌氯霉素类抗生素主要耐药基因携带情况

2.2 扩增产物的序列测定结果

将5株cat1基因阳性样品测序结果与NCBI基因库中cat1基因的同源性分析发现，1份样品的同源性为99%，4份样品的同源性为100%。16株cmlA基因阳性样品测序结果与NCBI基因库中cmlA基因的同源性分析发现,3份样品的同源性为99%，13份样品的同源性为100%。

3 讨论

细菌感染仍是世界范围内发病率和病死率的主要原因之一，由于多重耐药菌株的出现使这种情况变得复杂，导致治疗失败[6]。抗生素是用于治疗细菌感染的药物，由于药物使用不当和过度使用导致抗生素部分或完全失效，为疾病治疗带来巨大困难，在某些情况下无法医治[7]。特别是动物源耐药菌和耐药基因可以通过食物链传给人类[8]，从而严重威胁到人类健康。因此，动物源细菌耐药性监测不仅对动物细菌病的科学防治至关重要，同时对控制人类细菌病耐药性具有重要的现实意义。

氯霉素类药物的耐药性产生机制主要有氯霉素乙酰转移酶和泵系统两种机制，但氯霉素乙酰转移酶机制所产生的耐药性主要只针对氯霉素，而对氟苯尼考不起作用[9]。在对辽宁地区猪源大肠埃希菌氯霉素类主要耐药基因的检测时发现，在辽宁地区cmlA基因在猪源大肠埃希菌耐药菌株中普遍存在，cmlA介导的泵出机制是辽宁地区氯霉素类抗生素产生耐药性的主要原因。其次为cat1基因，与氯霉素乙酰转移酶的灭活有关。

加强动物源细菌的耐药性监测，掌握本地区细菌的主要耐药机制，不仅利于本地区动物疫病的综合防控，降低细菌病造成的经济损失，为其他地区动物疫病的防控提供参考，也可以控制耐药菌株和耐药基因通过食物链传给人类，降低因细菌耐药性而造成人类某些细菌病无药可治的风险。因此，有必要加强动物抗生素使用的管理，督促兽医临床合理用药，避免或延缓细菌耐药性及多重耐药现象的出现。

[1] Kheiri R,Akhtari L.Antimicrobial resistance and integron gene cassette arrays in commensalEscherichiacolifrom human and animal sources in IRI [J].Gut Pathog,2016,8(1):40.

[2] 陆 彦,晏志勋,赵红玉,等.印第安纳沙门氏菌对氯霉素类药物耐药性分析[J].微生物学通报,2013,40(7):1225-1230.

[3] Tian F,Wang C,Tang M,et al.The antibiotic chloramphenicol may be an effective new agent for inhibiting the growth of multiple myeloma[J].Oncotarget,2016,7(32):51934-51942.

[4] 杜向党,阎若潜,沈建忠.氯霉素类药物耐药机制的研究进展[J].动物医学进展,2004,25(2):27-29.

[5] Österberg J,Wingstrand A,Nygaard Jensen A,et al.Antibiotic resistance inEscherichiacolifrom pigs in organic and conventional farming in four European countries[J].PLoS One,2016,11(6):e0157049.

[6] Dzotam J K,Touani F K,Kuete V.Antibacterial activities of the methanol extracts ofCanariumschweinfurthiiand four other Cameroonian dietary plants against multi-drug resistant Gram-negative bacteria [J].Saudi J Biol Sci,2016,23(5):565-70.

[7] Ricciardi W,Giubbini G,Laurenti P.Surveillance and control of antibiotic resistance in the mediterranean region[J].Mediterr J Hematol Infect Dis,2016,8(1):e2016036.

[8] 赖 婧,刘 洋,汪 宇,等.800株不同动物源大肠杆菌的耐药性监测[J].中国兽医杂志,2011,47(4):12-14.

[9] 张洋龙,郎秀艳,蒋惠婷,等.黑龙江地区牛源大肠杆菌毒力和耐药基因检测分析[J].黑龙江畜牧兽医,2015(1):137-139.

Detection and Analysis of Chloramphenicols Resistance Genes inEscherichiacolifrom Swine

ZHAO Feng-ju,GUAN Miao,LI Qing-zhu,LI Jing-chun,LIANG Qiao,GU Gui-bo

(LiaoningPreventionandControlCenterofAnimalEpidemicDiseases,Shenyang,Liaoning,110164,China)

To find out the prevalence and distribution of chloramphenicols major resistance genes ofEscherichiacolifrom swine in Liaoning area,and provide scientific basis for prevention and treatment of swineE.coliinfection, cat1 and cmlA genes of chloramphenicols resistant strains were detected by polymerase chain reaction (PCR),and the cat1 and cmlA gene sequences were analyzed.Through the detection of drug resistance genes,cat1 gene and cmlA gene detection rates were 32% and 84%,8 strains were detected for cat1,cmlA genes.Therefore,cmlA gene is widespread presence inEscherichiacolistrains from swine in Liaoning region,cmlA mediated pump mechanism is the main reason for chloramphenicol resistance in Liaoning area; the second is the cat1 gene,associated with the inactivation of chloramphenicol acetyltransferase.

Escherichiacoli; chloramphenicols; drug resistance gene; polymerase chain reaction；swine

2016-11-04

辽宁省自然科学基金项目(201402573)

赵凤菊(1978-)，女，河北廊坊人，高级兽医师，硕士，主要从事动物人畜共患病的防控与研究。

S852.612;S859.796

A

1007-5038(2017)07-0049-03