陕西杨凌某蛋鸡场禽戊型肝炎病毒的检测

拓晓玲，刘宝元，陈宜阳，孙亚妮，赵 钦，周恩民

(西北农林科技大学动物医学院/农业部兽用药物与诊断技术陕西科学观测实验站，陕西杨凌 712100)



陕西杨凌某蛋鸡场禽戊型肝炎病毒的检测

拓晓玲，刘宝元，陈宜阳，孙亚妮，赵 钦，周恩民*

(西北农林科技大学动物医学院/农业部兽用药物与诊断技术陕西科学观测实验站，陕西杨凌 712100)

2014年-2015年陕西杨凌地区部分商品蛋鸡场产蛋量下降了10%～40%，剖检部分鸡只发现肝脏肿大出血。为确诊该疫情的病因，从发病的6个蛋鸡场采集了337份血清和268份粪便，利用间接ELISA和套式RT-PCR分别对血清中的禽戊型肝炎病毒(HEV)抗体和粪便中的禽HEV RNA进行了实验室检测。ELISA检测结果发现，168份血清为禽HEV抗体阳性，阳性率为49.85%；套式RT-PCR检测结果发现，63份粪便为禽HEV RNA基因片段阳性，阳性率为23.51%。基因片段的序列同源性分析发现，杨凌地区的禽HEV分离株与国内的同源性为93.0%～99.2%；进化树分析表明，其与国内其他地区的分离株在同一进化分支上，同属禽HEV基因3型。

禽戊型肝炎病毒；酶联免疫吸附试验；套式RT-PCR；序列分析

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是鸡的大肝大脾病(Big liver and spleen disease,BLS)或肝炎脾大综合征(Hepatitis-splenomegaly syndrome,HSS)的主要病原。该病毒感染主要引起30周龄～72周龄的蛋鸡和肉种鸡的产蛋量下降(10%～40%)和死淘率升高(1%～4%)，部分发病鸡腹部充血、卵巢退化，偶有肝脾肿大[1]。此外，禽HEV还可以引起鸡的亚临床感染，感染鸡只仅出现粪便排毒和病毒血症，并不表现其他临床症状。但当外界环境和饲料发生变化或与其他病原混合感染时，鸡群会出现产蛋率下降和死淘率升高，从而给鸡场造成严重的经济损失。目前，该病已先后在许多国家有过暴发的报道[2-9]，是危害养禽业尤其是蛋鸡和种鸡养殖业健康发展的重要疾病之一。

1997年，杨德吉等[10]首先从血清学方面证实了我国鸡群中禽HEV感染的存在。2010年，Zhao Q等[7]从患有HSS的病鸡中分离获得我国首例禽HEV。目前，血清学调查发现该病毒感染在我国鸡群中已广泛存在[11-12]。2014年-2015年陕西省杨凌地区的部分商品化蛋鸡场发生了不明原因的产蛋量下降(10%～30%)和死淘率升高(2%)，给养鸡场带来了严重的经济损失。临床剖检发现部分鸡只肝脏出血和肿大，怀疑该疫情可能是由禽HEV感染引起的鸡大肝大脾病。为了进一步明确该疫情是否由禽HEV感染引起，本研究从发病的6个蛋鸡场采集了337份血清和268份粪便，然后利用间接ELISA和套式RT-PCR分别对血清中的抗禽HEV抗体和粪便样品中的禽HEV RNA进行了检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 Superscript Ⅱ反转录酶和TRIzol试剂，Thermo Fisher Scientific公司产品； Transtaq High Fidelity DNA聚合酶、EasyPure Quick Gel Extraction试剂盒等常规的分子生物学试剂，北京全式金生物技术有限公司产品；pMD18-T Vector，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.2 样品来源 对杨凌地区发病的6个蛋鸡场进行样品采集(表1)，A鸡场分别采集50份血清样品和40份粪便样品；B鸡场分别采集52份血清样品和36份粪便样品；C鸡场分别采集48份血清样品和35份粪便样品；D鸡场分别采集60份血清样品和50份粪便样品；E鸡场分别采集65份血清样品和55份粪便样品；F鸡场分别采集62份血清样品和52份粪便样品。

1.2 方法

1.2.1 临床样品处理 将粪便样品用无菌PBS(0.01 mol/L ,pH 7.2)按照质量体积比制成10%悬浮液，4℃、3 500 r/min离心10 min，吸取200 μL上清液提取总RNA用于禽HEV RNA的检测。将采集的血液样品先放置37℃ 1 h,然后3 000 r/min离心10 min，吸取血清用于检测禽HEV抗体。

表1 杨凌地区6个商品化蛋鸡场血清和粪便样品的检测结果

1.2.2 禽HEV抗体检测 间接ELISA检测收集的血清样品中的禽HEV抗体[11]。具体方法简述如下：利用原核表达的截短的禽HEV ORF2蛋白为包被抗原，封闭洗涤后，加入100 μL待检的血清稀释样品(1∶50稀释)，室温孵育1 h洗涤后，加入100 μL稀释的HRP标记的羊抗鸡二抗(1∶6 000)，孵育洗涤后，加入TMB显色，3 mol/L浓硫酸终止反应，自动酶标仪450 nm读数。

1.2.3 禽HEV RNA检测 参照文献[13]，合成扩增ORF2部分序列的套式PCR引物，目的片段分别为278 bp和242 bp。首先按照TRIzol和Superscript Ⅱ反转录酶(Invitrogen)的使用说明书，从200 μL粪便悬液中进行总RNA的提取与反转录。然后按照Transtaq High Fidelity DNA 聚合酶(TransGen Biotech)说明书进行套式PCR扩增，最后取5 μL PCR产物于10 g/L 琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。

1.2.4 序列测定与分析 按照EasyPure Quick Gel Extraction试剂盒的说明书对扩增的阳性PCR产物进行胶回收，然后与pMD18-T Vector连接，筛选阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。利用DNA Star软件将获得的序列与GenBank上禽HEV的参考序列进行同源性和进化树分析。所用参考序列的GenBank登录号为KP221201、GQ398042、AY870827、FM872317、FM872312、AY870829、EU919193及FM872314。

2 结果

2.1 血清样品中禽HEV抗体的检测

利用间接ELISA对6个蛋鸡场收集到的血清样品进行禽HEV抗体的检测，结果发现337份血清样品中168份禽HEV抗体阳性，阳性率达到49.85%，不同场之间的阳性率为41.67%～58.33%(表1)。

2.2 粪便样品中禽HEV RNA的检测

应用TRIzol法对6个鸡场收集的粪便样品提取总RNA，然后利用禽HEV的特异性检测引物进行病毒 ORF2部分基因片段的扩增，琼脂糖凝胶电泳检测发现，收集的268份粪便样品中，63份出现了预期大小242 bp的目的片段，阳性率为23.51%。不同鸡场阳性率为18.00%～28.85%(表1)。

2.3 序列分析

将63份阳性PCR产物克隆测序后，序列比较发现，同一鸡场阳性样品的序列同源性为99.6%～100%，为同一禽HEV分离株；不同鸡场的同源性为94.2%～98.8%。对获得的6个鸡场的禽HEV ORF2基因的部分序列分别命名为China 15-YL-1、China 15-YL-2、China 15-YL-3、China 15-YL-4、China 15-YL-5及China 15-YL-6。然后利用DNA Star软件的MegAlign程序，将6个序列与GenBank上参考序列进行同源性分析，结果显示其与国内的禽HEV参考序列(China-908和China 09-G57)的同源性为93.0%～99.2%，与澳大利亚、美国、西班牙、德国及匈牙利等国的参考序列的同源性为73.4%～97.6%(表2)。

利用DNA Star软件包里的Clustal W程序构建进化树，结果显示6株禽HEV杨凌分离株与我国其他省份地区及欧洲和美国部分分离株在同一进化分支上，同属于禽HEV基因3型(图1)。

3 讨论

血清学调查发现，禽HEV感染在我国鸡群中已广泛存在[11-12]，并严重影响着我国蛋鸡和种鸡产业的健康发展。2013年，陕西省西安和咸阳等地区的部分蛋鸡场中也检测到了禽HEV感染的存在，但其对当地养鸡场的危害并没有引起相关从业人员的足够重视。2014年-2015年杨凌部分商品化蛋鸡场暴发了产蛋率下降和死淘率升高的疫情，给养殖场带来了严重的经济损失。通过对发病鸡只的剖检观察以及对养殖场禽流感和新城疫疫苗免疫的问卷调查，怀疑该疫情可能是由禽HEV感染引起的鸡大肝大脾病。随后，收集了6个发病鸡场的血清和粪便样品进行了实验室的诊断，结果显示6个鸡场均存在禽HEV的感染，并且粪便中病毒RNA的检出证实禽HEV的感染在上述鸡场中正在发生。此外，禽HEV抗体和RNA在6个蛋鸡场的检出说明了该病毒的感染在杨凌地区的蛋鸡场中已广泛流行，并给蛋鸡产业带来了严重的经济损失，必须引起当地相关养殖从业人员的注意。

表2 禽HEV ORF2基因序列与GenBank中部分禽HEV序列同源性分析

图1 禽HEV部分ORF2基因序列构建的进化树

利用DNA Star分析软件对获得的6个禽HEV杨凌分离株的ORF2部分基因片段与GenBank中参考序列进行同源性分析，结果显示其与国内的禽HEV参考序列(China-908和China 09-G57)的同源性最高，可能属于同一来源。此外，进化树结果显示，本研究的禽HEV分离株与国内其他地区的同属于基因3型，进一步说明了我国不同地区的养鸡场中仍主要存在基因3型禽HEV的感染[7]，是否存在其他基因型仍需要进一步的流行病学调查。

尽管已有报道禽HEV的垂直传播，但是目前仍认为粪-口途径的水平传播是该病的主要传播途径。此次杨凌地区不同蛋鸡场暴发了鸡大肝大脾病，其传染源或暴发原因仍需进一步的流行病学调查。目前，仍严重低估了禽HEV的感染对我国养禽业的危害，其相关的综合防控技术的研究也比较滞后，尚无特效疫苗和治疗药物。发病的养殖场应该及时清理粪便，加强饲养管理，定期对鸡舍及其活动场地进行消毒；其次减少应激，避免鸡群免疫力下降；最后鸡群饲喂保肝护肝药物，增强群体免疫力。

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Detection of Avian Hepatitis E Virus in Laying Hen Farms in Yangling Shaanxi Province

TUO Xiao-ling,LIU Bao-yuan,CHEN Yi-yang,SUN Ya-ni,ZHAO Qin,ZHOU En-min

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，ScientificObservingandExperimentalStationofVeterinaryPharmacologyandDiagnosis,MinistryofAgriculture,Shaanxi,Yangling,712100,China)

In 2014-2015,many laying hen flocks in Yangling of Shaanxi province had a decrease in egg production (10%-40%) in laying hens.Some necropsied laying hens showed liver hemorrhage and enlarged.To determine the causative agent of the disease,the 337 serum and 268 fecal samples were collected from 6 laying hen flocks.Subsequently,anti-avian hepatitis E virus (HEV) IgG antibodies in serum samples by indirect ELSIA and avian HEV RNA by nested RT-PCR (RT-nPCR) were tested.The results of indirect ELISA showed that the 168 serum samples were positive for anti-avian HEV IgG antibodies and the positive rate was 49.85%.The results of RT-nPCR showed that the 63 fecal samples were positive for avian HEV RNA and the total positive rate was 23.51%.Comparisons of the sequences from the positive fecal samples showed that they shared 93.0%-99.2% identities with the isolates from other provinces of China.Phylogenetic analysis showed that these strains were located in the same branch with other isolates in China and they all belonged to genotype 3 avian HEV.

Avian hepatitis E virus; ELISA; nested RT-PCR; sequence analysis

2016-11-22

“十三五”国家重点研发计划项目(2016YFD0500800)；国家自然科学基金项目(31372464，31402233，31672583)

拓晓玲(1984-)，女，陕西安塞人，兽医硕士，主要从事畜禽疫病的诊断。*通讯作者

S852.657；S858.31

B

1007-5038(2017)07-0120-04