40种中药提取物对6种临床常见感染菌株的体外抑菌活性观察

彭丹，马琼丽，陈泽慧，周小仙，陈安林，董泽令，杨欢，陈先恋

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2遵义医学院)



40种中药提取物对6种临床常见感染菌株的体外抑菌活性观察

彭丹1,2，马琼丽2，陈泽慧1，周小仙2，陈安林1，董泽令1，杨欢1，陈先恋1

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2遵义医学院)

目的 观察苏木、地榆、淫羊藿、黄连、白芍等40种贵州省常见中药对6种临床常见感染菌株的体外抑菌活性。方法 取40种中药(厚朴、陈皮、益母草、连翘、三七、虎杖、百部、菌陈、拳参、半夏、龙胆草、玄参、黄精、苦瓜、天冬、瓜蒌、淫羊藿、木蝴蝶、木香、姜黄、杜仲、白芨、木瓜、白头翁、地榆、苏木、白芍、紫草、山豆根、钩藤、黄药子、猪牙皂、黄柏、女贞子、山慈菇、黄连、石斛、栀子、枳壳、金钱草)制备水提取液或乙醇提取液。采用纸片琼脂扩散法(K-B法)测算40种中药提取物对6种标准菌株(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、肺炎链球菌)的抑菌圈直径。筛选出对标准菌株有抑菌作用(抑菌圈直径范围10～21 mm)的中药提取物，采用微量肉汤稀释法测定中药提取物对6种标准菌株及其临床分离耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)值。结果 K-B法显示15种中药提取物(三七、虎杖、半夏、龙胆草、玄参、黄精、瓜蒌、淫羊藿、木香、地榆、苏木、白芍、紫草、猪牙皂、黄连)对至少1种标准菌株有抑菌作用，抑菌圈直径为10～21 mm；黄连对肺炎链球菌、苏木对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为21、20 mm。15种中药MIC在15.63～1 000 mg/mL，其中黄连对肺炎链球菌、苏木对金黄色葡萄球菌的MIC值均为15.63 mg/mL，淫羊藿对肺炎链球菌、地榆对肺炎链球菌的MIC值均为31.25 mg/mL。筛选出5种抑菌活性较强的中药为苏木、地榆、淫羊藿、黄连、白芍，对6种临床分离的耐药菌株有不同程度的抑菌效果，其中苏木对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、黄连对产超广谱-β内酰胺酶肺炎链球菌的MIC50均为15.63 mg/mL。结论 40种中药中苏木、地榆、淫羊藿、黄连、白芍对临床常见感染菌株的抑菌活性较好，黄连对肺炎链球菌及苏木对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，苏木对铜绿假单胞菌和白芍、地榆对鲍曼不动杆菌也有一定抑菌效果。

中药；最小抑菌浓度；体外抑菌活性；中药提取物；药敏试验

近年来，细菌耐药性越来越严重，给临床抗感染带来了极大挑战。临床常见的耐药菌主要有产超广谱-β内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌、泛耐药的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐青霉素的肺炎链球菌、耐万古霉素和高水平耐氨基糖苷类的肠球菌等[1]，临床治疗这些耐药菌引起的感染可供选择的抗菌药物很少。中药价格低廉、来源广泛，有抗菌、抗炎、抗病毒、调节机体免疫功能等功效，且细菌不易产生耐药性。据文献报道，中药地榆、虎杖对金黄色葡萄球菌具有一定抑菌作用[2～4]；地榆、秦皮、石榴皮、黄连、黄芩等多味中药对产ESBLs大肠杆菌有不同程度的抑制作用[5]。本课题组前期研究发现五味子、石榴皮、连翘等多种中药提取物对产或不产MBL的铜绿假单胞菌均有一定抑菌作用[6]。为进一步了解中药提取物对临床常见致病菌株的体外抑菌效果，本研究根据相关文献[7～9]筛选出地榆、苏木、黄连、白芍等40种中药，对耐药率较高的6种常见菌株进行体外抑菌活性检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.1.1 仪器与试剂 Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪(法国梅里埃公司)，SB-2000减压旋转蒸发器(上海爱明仪器有限公司)，SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，磁力加热套，FA1004N电子天平(上海精密科学仪器公司)，M-H平板、血平板(贝瑞特公司)，肉汤(购自温州市康泰科技有限公司)。

1.1.2 试验中药 厚朴、陈皮、益母草、连翘、三七、虎杖、百部、菌陈、拳参、半夏、龙胆草、玄参、黄精、苦瓜、天冬、瓜蒌、淫羊藿、木蝴蝶、木香、姜黄、杜仲、白芨、木瓜、白头翁、地榆、苏木、白芍、紫草、山豆根、钩藤、黄药子、猪牙皂、黄柏、女贞子、山慈菇、黄连、石斛、栀子、枳壳、金钱草，40种中药均购自遵义医学院附属医院中药房。

1.1.3 试验菌株 标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠埃希菌ATCC 25922、鲍曼不动杆菌ATCC19606、粪肠球菌ATCC29212、肺炎链球菌ATCC49619，均购自上海宝录生物科技有限公司。临床耐药菌株：采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪对2016年我院送检标本检出的感染菌株进行鉴定及药敏试验，筛选出MRSA菌株、耐亚胺培南铜绿假单胞菌、产ESBL大肠埃希菌、耐亚胺培南鲍曼不动杆菌、高浓度庆大霉素耐药粪肠球菌、产ESBL肺炎链球菌各10株。

1.2 中药提取物的制备

1.2.1 水提取液制备 称取瓜蒌、淫羊藿、木蝴蝶、木香、姜黄、杜仲、白芨、木瓜、白头翁、地榆、苏木、白芍、紫草、山豆根、钩藤、黄药子、猪牙皂、黄柏、女贞子、山慈菇、黄连、石斛各10 g放入圆底烧瓶内，加蒸馏水100 mL，浸泡30 min后在80 ℃水浴锅中回流浸提，每次2 h，回流3次。收集3次滤液然后用旋转蒸发器旋转浓缩，浓缩至1 g/mL，置于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 乙醇提取液制备 称取益母草、连翘、三七、虎杖、百部、菌陈、拳参、半夏、龙胆草、玄参、黄精、苦瓜、天冬药材10 g放入圆底烧瓶内，加入100 mL 75%乙醇浸泡1 h后放入80 ℃水浴箱进行回流浸提，每次2 h、回流3次，收集滤液用旋转蒸发器旋转浓缩，浓缩至1 g/mL，4 ℃保存备用。按以上步骤制备厚朴、陈皮提取液，溶剂分别为乙酰乙酯、50%乙醇。

1.3 药敏试验 选取无菌空白纸片进行20 min高压蒸汽灭菌，灭菌后待用，取上述已制备好的中药提取物30 μL，滴加于灭菌完毕的空白纸片上，每种中药制备至少10张纸片备用。采用纸片琼脂扩散(K-B)法测量抑菌圈直径：用比浊仪调制6种标准菌株各0.5麦氏单位的菌液，涂布于M-H平板上，将上述40种中药纸片贴于M-H平板上，置于37 ℃培养箱16～24 h后测量抑菌圈直径。药物敏感性判定标准：抑菌圈直径>16 mm为高度敏感，11～15 mm为中度敏感，10 mm为轻度敏感，<10 mm为耐药或无抑制活性[10]。筛选出对细菌有抑菌作用(抑菌圈直径10～21mm)的中药，采用微量肉汤稀释法，测定相应中药提取物对标准菌株及其临床分离耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)值。

2 结果

K-B法结果显示，白芍、地榆对鲍曼不动杆菌中度敏感(抑菌圈直径分别为14、13 mm)；白芍对大肠埃希菌轻度敏感(抑菌圈直径10 mm)；白芍、半夏、三七、龙胆草、木香、苏木、地榆对铜绿假单胞菌中度敏感(抑菌圈直径分别为15、15、14、13、13、13、12 mm)，淫羊藿、玄参对铜绿假单胞菌高度敏感(抑菌圈直径分别为17、16 mm)；苏木、地榆对金黄色葡萄球菌高度敏感(抑菌圈直径分别为20、17 mm)，白芍、虎杖、黄连表现为中度敏感(抑菌圈直径分别为14、12、12 mm)；紫草对粪肠球菌高度敏感(抑菌圈直径16 mm)；黄连对肺炎链球菌高度敏感(抑菌圈直径21 mm)，白芍、地榆、淫羊藿、黄精为中度敏感(抑菌圈直径分别为15、14、12、11 mm)；以黄连对肺炎链球菌及苏木对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好。其余25种中药对6种标准菌株无抑菌作用。

15种中药(三七、虎杖、半夏、龙胆草、玄参、黄精、瓜蒌、淫羊藿、木香、地榆、苏木、白芍、紫草、猪牙皂、黄连)对6种标准菌株的MIC在15.63～1 000 mg/mL，以黄连对肺炎链球菌和苏木对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC值为15.63 mg/mL，具体结果见表1。根据表1结果筛选出5种抑菌活性较强的中药(淫羊藿、黄连、地榆、苏木、白芍)，对临床分离的产ESBL肺炎链球菌、MRSA菌株、耐亚胺培南鲍曼不动杆菌、耐亚胺培南铜绿假单胞菌、产ESBL大肠埃希菌均表现出抑菌作用，其中以黄连对产ESBL肺炎链球菌和苏木对MRSA菌株的抑菌效果最好，MIC值分别为7.81～15.63 mg/mL、15.63～31.25 mg/mL，MIC50值均为15.63 mg/mL；其次是淫羊藿对产ESBL肺炎链球菌和地榆对产ESBL肺炎链球菌的抑菌效果较好，MIC50值均为31.25 mg/mL；其余中药对6种临床菌株的MIC50值均≥125 mg/mL。

表1 有抑菌作用的15种中药对6种标准菌株的MIC(mg/mL)

3 讨论

多重耐药菌感染临床治疗非常棘手，病死率极高[11]。铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等是常见的临床感染菌株。MRSA、耐碳青霉烯类的肠杆菌科细菌、耐万古霉素肠球菌及广泛耐药的非发酵菌等细菌检出率逐年上升。国外有关文献报道[12]，2015年MRSA菌株的分离率高达31%。据我国同期细菌耐药监测网数据分析[13]，MRSA检出率为35.8%，对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌占59.0%。细菌高耐药性给临床用药带来很大困难，如泛耐药鲍曼不动杆菌导致感染的患者病死率为10%～43%[14]。由于可供选择的抗菌药物少、疗效差，寻找新的安全、低毒、有效的抗菌药物对抗多重耐药菌引起的感染成为亟待解决的问题。

现代研究证明中药具有抗菌效果、不易产生耐药性、毒性作用小等优点，从中药途径入手，为解决细菌耐药问题提供了新的思路。不同中药提取物对各类型细菌的抑菌效果也各不相同，如黄连、黄芩对产β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌有较好的抑菌效果[15～17]，夏枯草对金黄色葡萄球菌有显著抑菌效果[18]。本研究选取的40种中药中，有6种中药对肺炎链球菌有抑菌作用，分别是黄连、地榆、淫羊藿、瓜蒌、白芍、黄精，MIC为15.63～125 mg/mL，抑菌效果最明显的是黄连(MIC为15.63 mg/mL)。5种中药对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，分别是苏木、虎杖、地榆、黄连、白芍，MIC为15.63～125 mg/mL，以苏木的抑菌效果最好(MIC 15.63 mg/mL)。地榆和白芍对鲍曼不动杆菌有一定抑制作用，前者优于后者，MIC分别为62.5、250 mg/mL。目前尚无关于地榆对粪肠球菌和肺炎链球菌抑菌作用的研究，本研究结果显示地榆对粪肠球菌和肺炎链球菌均无抑菌作用。本研究中地榆对大肠埃希菌无抑菌作用，与文献报道[16]不一致，可能与中药的产地、炮制方法等有关。对铜绿假单胞菌有抑菌作用的中药有苏木、地榆、淫羊藿，但MIC较高，为250～500 mg/mL。仅白芍和苏木表现出对大肠埃希菌、粪肠球菌的抑菌作用。本次试验中山豆根、厚朴、陈皮、百部、半夏、益母草、拳参、苦瓜、天冬、黄药子、姜黄、杜仲、白芨、木瓜、白头翁、钩藤、黄柏、女贞子、山慈菇、石斛、栀子、枳壳、金钱草这25种中药对6种标准菌株无抑菌作用。

我们进一步选取5种对标准菌株抑菌效果较好的中药对临床分离的耐药菌株进行实验，结果显示，5种中药对临床耐药菌株有不同程度的抑菌作用，黄连对产ESBL肺炎链球菌的抑菌效果最好，MIC50为15.63 mg/mL，与黄连对其标准菌株的MIC值差异不大；苏木对MRSA菌株也具有较好的抑菌作用，MIC50为15.63 mg/mL；淫羊藿对产ESBL肺炎链球菌、地榆对产ESBL肺炎链球菌的MIC50值均为31.5 mg/mL；几种中药对临床分离菌株与标准菌株的MIC值一致。我们分析试验结果发现，地榆的抗菌范围大于其他中药，地榆对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的标准菌株和耐药菌株都有抑菌作用，这可能与地榆中含有鞣质、三萜皂苷等多种抑菌成分有关[19]。白芍对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株有抑菌作用，对临床分离的耐药菌株无抑菌作用，提示耐药菌株对部分中药提取物成分也具有一定的耐药性。

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In vitro antimicrobial activity of 40 kinds of Chinese herbal extracts on six common clinical infectious strains

PENGDan1,MAQiongli,CHENZehui,ZHOUXiaoxian,CHENAnlin,DONGZeling,YANGHuan,CHENXianlian

(1AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

Objective To observe the in vitro antibacterial activity of 40 kinds of common traditional Chinese medicine, such as Sumu (Sapanwood), Diyu(Sanguisorba officinalis), Yinyanghuo (Herba Epimedii), Huanglian (Rhizoma Coptidis), and Baishao (Radix Paeoniae Alba), etc. on the six common infectious strains. Methods Forty kinds of Chinese herbal medicine were selected to prepare the water extracts and ethanol extracts. Using the agar diffusion method (K-B method) to calculate the inhibitory zone diameter of 40 kinds of Chinese herb extracts on 6 standard strains (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii , Enterococcus faecalis, and Streptococcus pneumoniae) the antibacterial circle diameter. Screening out the Chinese herb extracts having antibacterial effect on standard strain (inhibition zone diameter range 10-21mm) of Chinese herbal extracts. Using broth microdilution method to test the minimum inhibitory concentration (MIC) of herbal extracts on six kinds of standard strains and clinical isolates. Results K-B showed that 15 kinds of Chinese herb extracts had inhibitory effects on at least one kind of standard strain, the diameter of inhibition zone was 10-21 mm. The MIC of 15 kinds of Chinese traditional medicine was 15.63-1 000 μg/mL. The MIC of Huanglian (Coptis chinensis) on streptococcus pneumoniae and Sumu (Sapanwood) on staphylococcus aureus was both 15.63 mg/mL. The MIC of Yinyanghuo (Epimedium) on streptococcus pneumoniae, Diyu (Sanguisorba) on streptococcus pneumoniae was 31.5 mg/mL. We selected 5 kinds of Chinese herbal medicine with strong antibacterial activity Sumu (Sapanwood), Diyu (Sanguisorba officinalis), Yinyanghuo (Herba Epimedii), Huanglian (Rhizoma Coptidis), Baishao (Radix Paeoniae Alba), which had different antimicrobial effects on 6 kinds of clinical isolates. The MIC50 of Sumu (Sapanwood) on methicillin-resistant staphylococcus aureus, and Huanglian (Rhizoma Coptidis) on ESBLs streptococcus pneumoniaeboth was both 15.63 mg/mL. Conclusions In 40 kinds of common traditional Chinese medicine, Sumu (Sapanwood), Diyu (Sanguisorba officinalis), Yinyanghuo (Herba Epimedii), Huanglian (Rhizoma Coptidis), and Baishao (Radix Paeoniae Alba) have the best in vitro antibacterial activity on the six common infectious strains. The inhibitory effect of Huanglian (Rhizoma Coptidis) on streptococcus pneumoniae and Sumu (Sapanwood) on staphylococcus aureus are the best. Sumu (Sapanwood) has a certain bacteriostatic effect on pseudomonas aeruginosa as well as Baishao (Radix Paeoniae Alba) and Diyu (Sanguisorba officinalis) on acinetobacter baumannii.

Chinese herbal medicine; minimal inhibitory concentration; antimicrobial activity in vitro; Chinese herb extracts; drug sensitive test

贵州省科技厅资助项目(黔科合-LH-2015-7480)。

彭丹(1992-)，女，硕士研究生，主要研究方向为细菌耐药机制。E-mail：359921159@qq.com

陈泽慧(1966-)，女，主任技师，主要研究方向为细菌耐药机制。E-mail：941291773@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.27.007

R932

A

1002-266X(2017)27-0027-04

2017-04-22)