复合酶深度酶解牡蛎制备呈味基料的研究

姚玉静 杨 昭 黄佳佳 崔 春

(1. 广东食品药品职业学院食品学院，广东 广州 510520；2. 华南理工大学食品科学与工程学院, 广东 广州 510640)



复合酶深度酶解牡蛎制备呈味基料的研究

姚玉静1杨 昭1黄佳佳1崔 春2

(1. 广东食品药品职业学院食品学院，广东 广州 510520；2. 华南理工大学食品科学与工程学院, 广东 广州 510640)

以牡蛎为原料，选用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶对其进行深度酶解，以水解度和感官评分为指标，通过单因素试验考察了胰蛋白酶与风味蛋白酶比例、酶添加量、酶解pH、酶解温度和酶解时间对牡蛎深度酶解的影响，对牡蛎深度酶解工艺进行优化，并对最优酶解条件下获得的牡蛎深度酶解产物的肽分子量分布和氨基酸组成进行分析。研究结果表明：牡蛎深度酶解最优工艺条件为胰蛋白酶与风味蛋白酶质量比为2∶1、蛋白酶添加量0.1%([E]/[S])、酶解pH 7.5、酶解温度 60 ℃、酶解时间 24 h，该条件下得到的牡蛎深度酶解产物中分子量<3 ku的多肽占83.5%，其中含有33.4%的分子量为1～3 ku的多肽和50.1%的分子量<1 ku的多肽。牡蛎深度酶解产物游离氨基酸中必需氨基酸含量为40.51%，鲜味氨基酸含量为17.50%，甜味氨基酸含量为30.60%。

牡蛎；深度酶解；呈味基料；调味品

近年来，中国调味品行业空前繁荣，已成为食品工业中增速最快的行业之一，并展现出向高档化、天然化发展的趋势[1]。当前在国际上有80%的调味品是复合调味品。呈味基料在高档复合调味品的配制中发挥着关键作用。呈味基料具有浓郁的鲜味和特征风味，且能提供饱满醇厚的口感[2]。蛋白质经深度酶解后可产生鲜味氨基酸和多肽，赋予酶解产物鲜味突出、口感饱满的特征，是制备呈味基料的重要方法。蛋白质酶解技术按照底物水解程度的增大和产物分子量的减小，分为轻度酶解、适度酶解和深度酶解[3]。深度酶解的产物主要是氨基酸和小肽，常用于制备调味品和营养液。目前虾[4]、低值鱼[5]、花生粕[6]等原料已被开发成呈味基料。

牡蛎(Oyster)是一种低脂肪高蛋白的海产品，味道鲜美，营养丰富，是中国四大养殖贝类之一。近年来利用生物酶法处理牡蛎制备呈味肽和生物活性肽，是牡蛎深加工的一个研究热点[7-9]。目前，国内外关于牡蛎酶解工艺优化制备单一酶解液的研究较多。冯金晓等[10-12]以水解度为单一指标，采用单酶或复合酶对牡蛎酶解参数进行优化。余杰等[13]以胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合酶，对牡蛎酶解动力学进行了研究。侯清娥等[14]以肽比例、感官分数为指标，采用胰蛋白酶，运用神经网络法优化牡蛎酶解制备呈味肽的工艺。梁帅峰等[15]采用中性蛋白酶对制备抗氧化活性的牡蛎酶条件进行了优化。冯丹丹等[16]考察了4种蛋白酶对牡蛎酶解过程中的矿质元素、氨基态氮、总酸和牛磺酸含量等成分的影响。上述研究都采用轻度酶解或适度酶解制备牡蛎酶解产物。由于呈味基料需要由游离氨基酸和小分子多肽共同形成圆润饱满的口感，因此采用深度酶解是开发牡蛎呈味基料的重要方法。目前未有文献报道深度酶解牡蛎制备呈味基料。

胰蛋白酶和风味蛋白酶具有水解效率高、酶解产物风味好、成本低廉、工业化应用广等特点，已在水产品酶解研究中广泛应用[17-18]。本研究以牡蛎为原料，选用胰蛋白酶和风味蛋白酶组成复合蛋白酶，通过单因素试验对牡蛎深度酶解工艺进行优化，分析最佳酶解工艺产物的肽分子量分布和氨基酸组成，以期为牡蛎呈味基料的深入研究提供理论与技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牡蛎：购于广州黄沙海鲜水产市场，牡蛎肉搅碎均匀后装于封口袋中，-18 ℃冻藏备用，使用前解冻；

胰蛋白酶：酶活 2.65×105U/g，广州明远工贸有限公司；

风味蛋白酶：酶活 500 LAPU/g，诺维信中国公司；

氨基酸标准品 ( 2. 5 μmol /mL) 、维生素B12(MW 1 855 u)、抑肽酶(MW 6 512 u)、细胞色素C(MW 12 384 u)、卵清蛋白(MW 43 000 u)：美国Sigma公司；

蔗糖、食用盐、味精：食品级；

其他试剂均为分析纯；

酸度计：S220型，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；

凯氏定氮仪：K9840型，济南海能仪器股份有限公司；

水浴振荡培养箱：TS-110×50型，上海天呈实验仪器制造有限公司；

分析天平：TLE104E型，梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司；

高速冷冻离心机：GL-21M型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

高效液相色谱：Waters 600型，美国沃特斯(Waters)有限公司；

全自动氨基酸分析仪：L8900型，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牡蛎深度酶解工艺

牡蛎原浆→解冻→稀释(牡蛎浆液与去离子水的质量比为1∶1)→调节pH(用0.05 mol/L氢氧化钠溶液)→酶解→灭酶(沸水浴20 min)→离心(8 000 r/min，15 min)→取上清液→牡蛎蛋白酶解产物→冻存备用

1.2.2 牡蛎深度酶解工艺中蛋白酶比例的确定 取解冻后牡蛎原浆50 g，加入50 g去离子水稀释后，酶解过程中用0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0(每1 h调pH值1次，使其维持在7.0)。蛋白酶添加量为0.05%(以牡蛎的重量计)，胰蛋白酶与风味蛋白酶质量比分别为2∶1，1∶1，1∶2，置于50 ℃摇床中酶解12 h。重复3次试验。考察不同蛋白酶比例对牡蛎深度酶解的影响。

1.2.3 牡蛎深度酶解工艺中蛋白酶添加量的确定 取解冻后牡蛎原浆50 g，加入50 g去离子水稀释后，酶解过程中用0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0(每1 h调pH值1次，使其维持在7.0)。胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2∶1，蛋白酶添加量分别为0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%(以牡蛎的重量计)，置于50 ℃摇床中酶解12 h。重复3次试验。考察不同蛋白酶添加量对牡蛎深度酶解的影响。

1.2.4 牡蛎深度酶解工艺中酶解pH的确定 取解冻后牡蛎原浆50 g，加入50 g去离子水稀释后，酶解过程中每1 h用0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值1次，使其分别维持在6.5，7.0，7.5，8.0，8.5。胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2∶1，蛋白酶添加量为0.1%(以牡蛎的重量计)，置于50 ℃摇床中酶解12 h。重复3次试验。考察不同酶解pH对牡蛎深度酶解的影响。

1.2.5 牡蛎深度酶解工艺中酶解温度的确定 取解冻后牡蛎原浆50 g，加入50 g去离子水稀释后，酶解过程中用0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5(每1 h调pH值1次，使其维持在7.5)。胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2∶1，蛋白酶添加量为0.1%(以牡蛎的重量计)，分别置于温度为45，50，55，60 ℃的摇床中酶解12 h。重复3次试验。考察不同酶解温度对牡蛎深度酶解的影响。

1.2.6 牡蛎深度酶解工艺中酶解时间的确定 取解冻后牡蛎原浆50 g，加入50 g去离子水稀释后，酶解过程中用0.05 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5(每1 h调pH值1次，使其维持在7.5)。胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2∶1，蛋白酶添加量为0.1%(以牡蛎的重量计)，分别置于60 ℃摇床中酶解6，12，18，24，30，36 h。重复3次试验。考察不同酶解时间对牡蛎深度酶解的影响。

1.2.7 蛋白水解度的测定 总氮含量根据GB 5009.5—2010测定。氨基酸态氮含量根据甲醛滴定法测定[19]。水解度(DH)按式(1)计算[20]：

(1)

式中：

DH——水解度，%；

AN——氨基酸态氮含量，g；

N——原料总氮含量，g。

1.2.8 酶解产物感官评定 根据文献[21]，选取5男5女，共10名年龄在16～25岁的感官评定员，在温度为(24±1) ℃的感官评价室进行感官评定。感官评定员在感官评定之前经过基本滋味培训，熟悉牡蛎酶解产物的风味特征和感官强度，进行培训的标准品分别是甜味(1%蔗糖)，咸味(0.35%食用盐)，鲜味(0.2%味精)，苦味(0.02 g/L盐酸奎宁)，酸味(0.04%柠檬酸)。评定步骤：评定员取5 mL待测样液放于口中，样液在口中停留 20～25 s，之后吐掉，根据感官评定标准(见表1)对此次感官结果给予记录。

1.2.9 酶解产物肽分子量分布测定 根据文献[22]，将牡蛎酶解清液稀释至蛋白浓度为1 mg/mL，使用高效液相色谱测定酶解清液中肽分子量分布情况，凝胶柱型号为TSk gel G2000 SWXL分析柱，洗脱液为磷酸缓冲液(0.04 mol/L)，流速 1 mL/min，检测波长214 nm。标准肽样品分别为：维生素B12(MW 1 855 u)、抑肽酶(MW 6 512 u)、细胞色素C(MW 12 384 u)、卵清蛋白(MW 43 000 u)。根据标准样品的洗脱时间得到标准曲线方程：

y=-0.164 7x+6.543 1(R2=0.993 6)，

(2)

式中：

y——分子量的对数；

x——保留时间，min。

表1 感官评判标准

1.2.10 酶解产物氨基酸组成分析 根据GB/T 5009.124-2003测定，采用全自动氨基酸分析仪测定。肽的氨基酸含量按式(3)计算：

A=A1-A2，

(3)

式中：

A——肽的氨基酸含量，mg/100 g；

A1——总氨基酸含量，mg/100 g；

A2——游离氨基酸含量，mg/100 g。

1.2.11 数据分析 所有的试验均进行3次。统计分析采用Excel 2010和SPSS 20.0软件，数据采用平均数±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 牡蛎深度酶解工艺条件优化

2.1.1 蛋白酶比例对牡蛎深度酶解产物感官和水解度的影响 胰蛋白酶为碱性内切酶，风味蛋白酶为中性内切兼外切酶，2种酶组成复合酶，具有酶切效率高和产物风味好的特点[13]。由图1可知，随着胰蛋白酶比例的增多，水解度逐渐升高。当胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2∶1时，酶解产物水解度最高为25.22%，感官评分为5.5。而胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1∶2时，酶解产物感官评分最高为6.0，水解度为20.63%。由于感官评分差别不大，从原料利用度的角度考虑，选取水解度高的蛋白酶比例。因此，确定牡蛎深度酶解的胰蛋白酶与风味蛋白酶质量比为2∶1。

相同字母表示 0.05 水平上差异未达到显著性水平，不同字母表示 0.05 水平上差异达到显著性水平。

图1 蛋白酶比例对牡蛎酶解产物水解度和感官的影响

Figure 1 Effect of different the proportion of trypsin and flavourzyme on the hydrolysis degree and sensory analysis

2.1.2 蛋白酶添加量对牡蛎深度酶解产物感官和水解度的影响 由图2可知，随着蛋白酶添加量的增多，水解度逐渐增加，而感官评分却逐渐降低。当蛋白酶添加量为0.05%时，酶解产物感官评分最高为5.3，水解度为33.68%。当蛋白酶添加量为0.1%时，酶解产物水解度为42.28%，感官评分为4.7。从原料利用度和酶解产物感官评价角度综合考虑，选取牡蛎深度酶解的蛋白酶添加量为0.1%。

相同字母表示 0.05 水平上差异未达到显著性水平，不同字母表示 0.05 水平上差异达到显著性水平。

图2 蛋白酶添加量对牡蛎酶解产物水解度和感官的影响

Figure 2 Effect of different the content of protease on the hydrolysis degree and sensory analysis

2.1.3 酶解pH对牡蛎深度酶解产物感官和水解度的影响 酶解体系的酸碱环境会影响酶的活力。pH通过改变底物的解离状态，影响底物与蛋白酶的结合。特别是影响酶催化所需要的侧链基团的解离状态，进而影响水解效果。文献[13,16]报道胰蛋白酶和风味蛋白酶的最适pH分别为8.0，7.0。由图3可知，酶解pH对感官评分和水解度影响不大。当酶解pH为7.5时，酶解产物水解度最高为47.82%，感官评分最高为4.8。胰蛋白酶在最适pH条件下有较强的水解能力，而风味蛋白酶在较佳pH条件下赋予水解产物较好的风味。综合考虑感官评分和水解度2个指标，选取牡蛎深度酶解的pH为7.5。

2.1.4 酶解温度对牡蛎深度酶解产物感官和水解度的影响 酶催化的反应速度与温度关联度较大。温度升高，反应速度也相应的提高，但酶失活的速率也随之增大。温度降低，酶催化反应的速率也随之降低，同时在长时间酶解过程中，反应体系易受到微生物的污染。文献[17-18]报道胰蛋白酶和风味蛋白酶的最适酶解温度分别为45，55 ℃。但同一种酶与不同的底物进行酶解所表现出来的最适温度可能不同[23]。 胰蛋白酶水解牡蛎的最适温度为58.6 ℃，水解乳蛋白最适温度为55 ℃[14,24]。因此对于不同的酶解体系，研究酶解温度是非常有必要的。

相同字母表示 0.05 水平上差异未达到显著性水平，不同字母表示 0.05 水平上差异达到显著性水平。

图3 酶解pH对牡蛎酶解产物水解度和感官的影响

Figure 3 Effect of enzymolysis pH on the hydrolysis degree and sensory analysis

由图4可知，酶解温度从45 ℃增加到55 ℃，水解度呈缓慢增大，60 ℃时急剧下降。而感官评分却缓慢升高。当酶解温度为55 ℃时，酶解产物水解度最高为57.87%，此时的感官评分却相对较低。当酶解温度为60 ℃时，酶解产物水解度最低为38.10%，此时的感官评分却相对最高，主要体现在产品鲜味相对突出。可能是在较高的酶解温度下，鲜味氨基酸或多肽等物质更有利于溶出。朱新武[25]在研究鸡肉酶解时，也发现胰蛋白酶在60 ℃酶解鸡肉时鲜味评分最高。考虑到呈味基料感官性能的重要性，选取牡蛎深度酶解的温度为60 ℃。

相同字母表示 0.05 水平上差异未达到显著性水平，不同字母表示 0.05 水平上差异达到显著性水平。

图4 酶解温度对牡蛎酶解产物水解度和感官的影响

Figure 4 Effect of enzymolysis temperature on the hydrolysis degree and sensory analysis

2.1.5 酶解时间对牡蛎深度酶解产物感官和水解度的影响

由图5可知，随着酶解时间的延长，牡蛎酶解产物水解度逐渐提高，而感官评分却呈现先缓慢升高再缓慢降低的趋势。在6～30 h时，水解度增加趋势较快，30 h的水解度比6 h的增加了26.14%，而在30～36 h时，水解度保持不变，表明蛋白已充分水解为氨基酸和多肽。当酶解时间为24 h时，感官评分相对最高，此时水解度为55.32%。侯清娥[26]采用0.1%酶解样液重量的胰蛋白酶(4 000 U/g)酶解牡蛎蛋白6 h，获得水解度为45.55%酶解液，且具有浓郁海鲜风味、甘甜、微酸的感官。因此，选取牡蛎深度酶解的时间为24 h。

相同字母表示 0.05 水平上差异未达到显著性水平，不同字母表示 0.05 水平上差异达到显著性水平。

图5 酶解时间对牡蛎酶解产物水解度和感官的影响

Figure 5 Effect of enzymolysis time on the hydrolysis degree and sensory analysis

2.2 牡蛎深度酶解产物肽分子量分布

相同浓度下，小分子量的多肽比某些氨基酸更容易被肠道吸收，且分子量<5 ku的多肽，可呈现甜、酸、苦、咸、鲜5种基本味觉，是高档复合调味品的重要呈味基料[27]。因此，了解牡蛎深度酶解产物的多肽分子量分布具有重要的意义。

本研究选取胰蛋白酶与风味蛋白酶质量比为2∶1、蛋白酶添加量为0.1%(以牡蛎重量计)、酶解pH为7.5、酶解温度为60 ℃、酶解时间为24 h的最佳工艺条件进行牡蛎深度酶解，制备得到牡蛎深度酶解产物，水解度和感官评分分别为55.01%和6.0。用高效液相色谱法测定酶解产物中的肽分子量分布，试验结果见表2。

由表2可知，牡蛎深度酶解产物中分子量<3 ku的多肽占83.5%，其中含有33.4%的分子量为1～3 ku的多肽和50.1%的分子量<1 ku的多肽，而分子量在3～5，5～10，10 ku以上的多肽所占比例比较低，分别为9.0%，6.0%，1.5%。由此可见，在牡蛎深度酶解最优工艺条件下，牡蛎深度酶解的效果显著，得到的酶解产物以<3 ku的小分子量肽为主。

2.3 牡蛎深度酶解产物氨基酸组成分析

酶解产物中游离的鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸的组成变化对酶解液的主体风味有着重要的影响。利用全自动氨基酸分析仪对优化出的牡蛎深度酶解产物进行氨基酸分析，结果见表3。

表2 酶解产物多肽分子量分布

表3 酶解产物氨基酸组成†

† 氨基酸滋味特征：谷氨酸、天冬氨酸呈鲜味；丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸呈甜味；组氨酸、精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸呈苦味。

由表3可知，牡蛎深度酶解产物游离氨基酸中具有高达 40.51%的必需氨基酸(缬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸)，营养价值比较高。30.60%的甜味氨基酸和17.50%的鲜味氨基酸是作为良好呈味基料的基础，其中谷氨酸比例最高为13.22%。同时，其苦味氨基酸含量也达到了51.90%。肽的氨基酸总含量与游离氨基酸总含量基本一致。尽管游离氨基酸中苦味氨基酸含量较高，但整体感官评定中苦味不突出，产物鲜味评定分数较高，可能是酶解液中的小分子多肽起了主要鲜味作用或产生的醇厚感肽对鲜味起了增强作用[28]。

3 结论

通过单因素试验，以水解度和感官评分为指标，确定牡蛎深度酶解最佳工艺条件为：胰蛋白酶与风味蛋白酶质量比2∶1，蛋白酶添加量0.1%([E]/[S])，pH 7.5，酶解温度60 ℃，酶解时间24 h。在最佳工艺下对牡蛎进行深度酶解，牡蛎深度酶解产物水解度和感官评分分别为55.01%和6.0。所获得的牡蛎深度酶解产物中分子量<3 ku的多肽含量为83.5%，其中含有33.4%的分子量为1～3 ku的多肽和50.1%的分子量<1 ku的多肽。牡蛎深度酶解产物游离氨基酸中必需氨基酸含量为40.51%，鲜味氨基酸含量为17.50%，甜味氨基酸含量为30.60%，苦味氨基酸含量为51.90%。在试验中发现，深度酶解产物具有一定的腥味等不良风味，如何减少此不良风味是牡蛎深度酶解产物作为呈味基料应用的关键，也是下一步研究目标。

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Study on the effects of preparate flavor base material by high degree of enzymatic hydrolysis of oyster with compound enzymes

YAO Yu-jing1YANG Zhao1HUANG Jia-jia1CUI Chun2

(1. Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou, Guangdong 510520, China; 2. College of Food Science and Technology, South China University of Technology, Guangzhou, Guangdong 510640, China)

The compound enzymes consisted of trypsin and flavourzyme were used for high degree of hydrolyze oyster. The degree of hydrolysis (DH) and sensory analysis of oyster as index parameter, and single factor experiment was used for investigated the process of enzymatic hydrolysis of oyster. The peptide molecular weight distribution and amino acid composition of the optimized enzymatic hydrolysate were analyzed. The results showed that the best enzymatic hydrolyse conditions for oyster was the proportion of trypsin and flavourzyme was 2∶1(w/w), and the quantity of compound enzymes was 0.1% ([E]/[S]), at 60 ℃ for 24 h in the solution of pH 7.5. The oyster high degree of enzymatic hydrolyse products could be obtained by the optimum technological conditions, containing 83.5% molecular weight less than 3 ku, and among them less than 1 ku contained 50.1%, 1～3 ku peptide contained 33.4%. The content of essential amino acids in the free amino acids of the oyster hydrolyzate was 40.51%, and the contents of the umami amino acid and the sweet amino acid were 17.50% and 30.60%, respectively.

oyster; high degree of enzymatic hydrolysis; flavor base material; seasoning

广州市科技计划项目(编号：201604020067)

姚玉静，女，广东食品药品职业学院副教授，硕士。

崔春(1978—)，男，华南理工大学教授，博导，博士。 E-mail: cuichun@scut.edu.cn

2017—04—14

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.036