“探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化”实验疑难点解答

高 芳

(浙江省台州市第一中学 318000)

“探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化”是高中生物学必修教材中的实验。该实验利用血细胞计数板进行酵母菌的显微计数，并建立数学模型解释种群数量动态变化规律。无论是实验技术操作、实验结果分析，还是实验内容探究等方面都值得开展。但在实际操作过程中，由于教材很多步骤没有详细地解释，无菌操作和血细胞计数板的使用等技术学生未曾接触。因此，实验难度较大，开出率较低。本文针对该实验过程中的一些疑难问题提出解决方法，为该实验的广泛开展提供经验。

1 血细胞计数板能否选用普通盖玻片

买来的血细胞计数板没有盖玻片，能否使用实验室普通盖玻片？若使用普通盖玻片，会因为盖片太小(18 mm×18 mm)而不能覆盖全2个计数室，且质量较轻(厚0.13～0.17 mm，约0.14～0.15 g/个)，不能保证计数室的高度恒定。专用血盖片(22 mm×26 mm)较大的面积足以盖全2个计数室，较重的质量(厚0.5 mm，约0.55 g/个)能保证计数室的高度为0.1 mm。

2 酵母菌稀释倍数

酵母菌数量过多时，需要进行稀释操作。浙科版高中生物学必修三教材中提及10倍稀释的方法[1]，往往使学生误解而直接进行10倍稀释，造成计数室酵母菌数量过少，引起实验误差，此时教师应怎样指导学生进行合理稀释呢？

教师可以指导学生在计数前进行稀释的预实验：先对原液大致计数，根据估算数目选择合适倍数进行稀释，实际操作中，最开始的稀释只需1～2倍即可。那么稀释至计数多少细胞数为宜呢？教材要求“计数总数不少于300个细胞”，但当“方格内细胞数目多于300个或者数不过来，可以用稀释的方法”[1]。此处“计数总数不少于300个细胞”，应是针对规格为25格×16格的计数板中5个中方格的计数总数(规格为16格×25格的计数板则指4个中方格)，即要求每个中方格计数不少于60个。而“方格内细胞数目多于300个则要稀释”，则应是指每个中方格的计数数目。因此，实际操作时，以每个中方格计数 100个左右为宜，数量太多会使计数难度加大，太少会因稀释过多而产生误差。

3 血细胞计数板看不清竖线

血细胞计数板在调焦清晰的情况下，即使视野清晰，也会出现只能看到横线而看不到竖线的情况，此时难以确定计数室的位置，该如何解决？因为血细胞计数板线条无色，所以显微镜观察时，视野光线应调暗一些。碰到上述情况，可以将反光镜向侧面适当地翻转调试至某个角度，使得光线强度适当降低，就可以清晰地看到血细胞计数板的竖线。

4 血细胞计数板难以清洗干净

很多人对血细胞计数板的清洗并不在意，在计数完成后，不及时清洗，或简单清洗晾干后便用于下次计数。而在再次镜检时，发现前次计数的酵母菌仍残留在计数板表面，严重干扰再次观察计数。怎样才能将血细胞计数板彻底清洗干净？首先在使用后应立即清洗，防止细胞失水后黏在计数板上。其次，可用擦镜纸蘸取酒精擦拭，流动水冲洗数次。如果仍然不干净，需泡酸后用蒸馏水冲洗。血细胞计数板若使用擦镜纸擦干，会带来杂质，可用吹风机吹干或让其自然风干。

5 加样时先加菌液还是先盖盖玻片

加样到血细胞计数板上时，是先滴加菌液再盖盖玻片，还是先盖盖玻片再滴加菌液？血细胞计数板表面有凹槽(图1)，若先加菌液再盖盖玻片，血盖片落下时极易产生气泡，还可能造成菌液过量，计数室高度超过1 mm，这些都会造成计数误差。因此，建议加样时先盖盖玻片，在盖玻片的边缘滴加适量菌液，利用毛细作用将菌液渗入盖玻片下，以保证菌液量合适，且避免气泡的产生。

图1 血细胞计数板侧面观模式图

6 每组培养试管选用多支还是一支

酵母菌培养过程中，每组培养所使用的试管，是自始至终只用1支，还是每组多支试管，每天取其中1支计数，不重复使用？通过将这两种情况设置对照实验发现，如仅用1支试管，存在重复取样带来污染及计数体积变化带来误差的问题，若试管不小心破碎，该组实验则不能继续进行。因此，建议每组选用多支试管，每天取其中1支计数，不重复使用的实验设计，可有效避免以上问题。

7 绘制曲线使用单组数据还是全部数据

将不同时间段的酵母菌数绘制成曲线时，是使用单组数据绘制成多条曲线，还是将全班所有数据汇总绘制成1条曲线？利用SPSS软件将数据拟合成S型曲线可知，仅用单组数据，每条曲线的拟合度都较低，建立数学模型存在较大误差；把全班所有数据汇总取平均值，曲线拟合度显著提高，达到数学模型建立的要求。因此，建议将全部数据汇总绘制成一条曲线。

8 实验计数误差的来源

当所有操作都按规范进行，但血细胞计数板的不同计数方格间、同一试管样品的重复测量间、同一处理的不同试管间酵母菌计数仍存在较大误差，是什么原因导致的呢？学生亲身实践操作后，通过互相探讨，普遍认同混匀这个操作对计数误差起到关键作用，且容易忽视。取样前摇匀、稀释后摇匀以保证菌液密度均一，加样前吹打均匀以保证菌液随机散布计数室，这些都是避免出现计数误差的操作细节。