血管性痴呆大鼠肾素-血管紧张素-醛固醇系统的动态变化

李蓓华 鲁国洲 黄新武

(西南医科大学药学院，四川 泸州 646000)



血管性痴呆大鼠肾素-血管紧张素-醛固醇系统的动态变化

李蓓华 鲁国洲1黄新武

(西南医科大学药学院，四川 泸州 646000)

目的 观察血管性痴呆(VD)大鼠血浆和脑组织肾素-血管紧张素(Ang)-醛固酮(ALD)系统(RAAS)的动态变化。方法 经水迷宫筛选出学习记忆能力正常雄性SD大鼠80只随机分入正常组、模型组(1 d)、模型组(3 d)、模型组(7 d)、模型组(14 d)、模型组(21 d)、模型组(30 d)，按照设计时间梯度采用不同时点分别结扎左、右双侧颈总动脉法制备VD模型大鼠。观察正常组和模型组(30 d)的空间学习记忆情况，检测血浆、脑皮质及海马肾素活性、AngⅡ、ALD水平以及脑组织病理学检查。结果 模型组(30 d)和正常组水迷宫数据比较差异显著(P<0.05)，说明模型制备成功。血浆、皮质及海马中肾素活性、AngⅡ及ALD的水平模型组随时间增加其水平总体呈现增高趋势，但脑组织与血浆水平变化无线性相关性；脑组织光镜下病理学观察发现，随缺血时间增加脑皮质及海马损伤有加重趋势。结论 RAAS在脑缺血的发生发展中有着重要作用。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统；脑缺血；血管性痴呆

高龄人群中血管性痴呆(VD)患者比老年痴呆有更高的死亡率〔1〕。VD发病的确切机制尚不十分清楚。近年研究提示大脑中存在独立于外周的肾素-血管紧张素(Ang)-醛固酮(ALD)系统(RAAS)，具有调节大脑生理和病理性作用〔2〕。中枢RAAS中的Ang与学习、记忆密切相关〔3〕。然而在缺血性脑损伤中脑内RAAS的变化及其作用机制至今仍未完全阐明，本文探讨脑缺血所致VD的RAAS动态变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠100只，体重(200±10)g，SPF级，由泸州医学院SPF动物医学实验中心提供。

1.2 主要实验试剂及设备 碘【125I】AngⅠ(批号：20140320)、125I AngⅡ(批号：20140320)、125I ALD(批号：20140320)，由北京北方生物技术研究所提供，SN-695Bγ放射免疫计数仪(上海核辐日环一厂)、低温离心机(ST16R)〔赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕、电子天平(上海精科-上海仪电科学仪器有限公司)、Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模及分组 不同时点永久性结扎左、右颈总动脉造模〔4〕。实行双重结扎(结扎处间隔2 cm左右)，保证结扎稳固阻断血流。经过水迷宫筛选出学习记忆能力正常雄性SD大鼠80只，随机分入：正常组、模型组(1 d)、模型组(3 d)、模型组(7 d)、模型组(14 d)、模型组(21 d)、模型组(30 d)。按照造模方法依设计时间梯度进行手术。

1.3.2 水迷宫实验 选取正常组及模型30 d组行定位航行实验：1 w左右，每天将动物从4个入水点面朝池壁轻轻放入水中，记录大鼠从入水至找到平台的游泳轨迹及逃避潜伏期。每次时间为120 s，如果120 s内未找到平台，则将大鼠放在平台上20 s，并记录潜伏期为120 s。

1.3.3 标本采集及处理 实验设计时间截止时，大鼠禁食过夜，各组取5只称重后，1%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g 麻醉，腹主动脉取血，加入配置好的抗凝真空采血管内，4℃，3 000 r/min,离心10 min,收集血浆，-20℃保存。取血后，断头取脑，立即分离皮质和海马，称重，匀浆，4℃3 000 r/min,离心10 min,收集上清液，-20℃保存；各组取一部分大鼠称重后，1%戊巴比妥钠0.3 ml/100 g麻醉，进行心脏灌注固定，断头取脑，放入4%多聚甲醛继续固定过夜，包埋切片。

1.3.4 指标检测 血浆及匀浆指标采用放免法进行测定，按照试剂盒说明书步骤进行测定。其中肾素活性的测定实际上是测定血浆中AngⅠ的产生速率，即肾素活性=(测定管AngⅠ浓度37℃-对照管AngⅠ浓度4℃)/样品温育时间。脑病理学检查：各组大鼠包埋脑组织从出现海马时开始连续切片，每个脑组织连续切片10张，间隔选取，HE染色。光镜下观察脑皮质及海马病理学变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 水迷宫定位航行实验 模型组(30 d)及正常组大鼠逃避潜伏期随实验天数增加均呈现逐步减少的趋势，但模型组(30 d)大鼠减少趋势较弱；与正常组相比较，模型组(30 d)逃避潜伏期有显著差异(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠血浆、脑皮质及海马肾素活性水平 血浆：与正常组相比较，模型组(7 d)、模型组(14 d)有显著差异(P<0.05)；脑皮质：与正常组相比较，模型组(30 d)有显著差异(P<0.05)；脑海马：与正常组相比较，模型组(14 d)、模型组(21 d)、模型组(30 d)有显著差异(P<0.05)。随时间变化，血浆、脑皮质及海马肾素活性水平总体呈增强趋势。各组大鼠肾素活性水平相关性分析，皮质与血浆(r=0.068，P>0.05)、海马与血浆均无相关性(r=0.525，P>0.05)，表明皮质和海马与血浆肾素活性水平无线性相关关系。见表2。

2.3 各组大鼠血浆、脑皮质及海马AngⅡ水平 血浆：与正常组相比较，模型组(21 d)、模型组(30 d)有显著差异(P<0.05)；脑皮质：与正常组相比较，模型组(1 d)、模型组(3 d)、模型组(7 d)、模型组(14 d)、模型组(21 d)、模型组(30 d)有显著差异(P<0.05)；脑海马：与正常组相比较，模型组(14 d)、模型组(21 d)、模型组(30 d)有显著差异(P<0.05)。随时间变化，血浆、脑皮质及海马AngⅡ水平总体均趋向升高。各组大鼠AngⅡ水平相关性分析，皮质与血浆(r=0.081，P>0.05)，海马与血浆无相关性(r=0.663，P>0.05)，表明皮质和海马与血浆AngⅡ水平无线性相关关系。见表2。

2.4 各组大鼠血浆、脑皮质及海马ALD水平 与正常组相比较，模型组(1 d)、模型组(21 d)有显著差异(P<0.05)；脑皮质：与正常组相比较，模型组(1 d)、模型组(3 d)、模型组(7 d)、模型组(30 d)有显著差异(P<0.05)；脑海马：与正常组相比较，模型组(14 d)有显著差异(P<0.05)。随时间变化，血浆、脑皮质及海马ALD水平总体处于高水平波动。各组大鼠ALD水平相关性分析，皮质与血浆(r=0.596，P>0.05)，海马与血浆无相关性(r=-0.176，P>0.05)，表明皮质和海马与血浆ALD水平无线性相关关系。见表2。

2.5 各组大鼠脑皮质HE染色 正常组大鼠皮质细胞数量及分布正常，皮质各层结构正常，蓝染较为均匀，排列较为规律。与正常组比较，各模型组大鼠皮质细胞分布出现异常，主要表现在数量减少；胞核染色加深，胞核固缩；局部可见皮质细胞有核溶解、核碎裂。随脑缺血时间梯度的推进，可见皮质缺血病理变化，皮质细胞数量有一定减少，胞核外形改变、固缩，局部可见核溶解、核碎裂。见图1。

2.6 各组大鼠脑海马HE染色 正常组大鼠海马细胞数量及分布正常，胞核蓝染，着色较为均匀，排列紧密。与正常组比较，各模型组大鼠海马细胞分布出现异常，主要表现在数量减少；胞核染色加深，可见胞核固缩，有核溶解、核碎裂。随脑缺血时间增加，可见海马细胞密度降低，胞核变形、固缩，核溶解、核碎裂。见图2。

表1 各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期

与正常组比较:1)P<0.05，下表同

表2 各组大鼠血浆、脑皮质及海马肾素活性、AngⅡ、ALD水平水平

图1 各组大鼠脑皮质HE染色(×400)

图2 各组大鼠脑海马HE染色(×400)

3 讨 论

研究发现，AngⅡ受体拮抗药坎地沙坦与Ca2+通道阻滞剂氨氯地平的比较治疗中，坎地沙坦有着明显的神经保护作用，同时利尿剂同样能够很好地减少血容量，降低血压，消除水肿，但却未发现神经保护功能〔5〕。由此可以推测，RAAS在血管性脑缺血的过程中，有超越血压调控及水盐代谢调节的作用。RAAS在脑缺血后的损伤过程中有着重要作用，其能够进一步加重神经细胞损伤，有实验证明，AngⅡ激活转化生长因子(TGF)-β的释放，促进炎症反应〔6〕。

本研究显示，RAAS在VD大鼠脑皮质和海马中水平升高，HE染色脑皮质及海马缺血损伤加重，表明RAAS成为脑缺血损伤的活跃危险因素。且血浆、脑皮质及海马肾素活性、AngⅡ、ALD水平随缺血时间增加而总体表现增高趋势，但其在脑组织与血浆间无线性关系，光镜下病理学观察皮质及海马细胞随时间延长脑细胞损伤加重，这说明脑缺血后损伤与RAAS活性增加有一定关系，且脑组织RAAS的变化与血浆不一致，具有一定的独立性。这为预防缺血性脑损伤提供了一个较好的方向。

1 Tschanz JT,Corcoran C,Skoog I,etal.Dementia：the leading predictor of death in a defined elderly population：the Cache County Study〔J〕.Neurology,2004;62(7):1156-62.

2 Hajjar I,Hart M,Milberg W,etal.The rationale and design of the antihypertensives and vascular,endothelial and cognitive function(AVEC)trial in elderly hypertensives with early cognitive impairment:role of the renin angiotensin system inhibition〔J〕.BMC Geriatr,2009;9(1):48.

3 Ciobica A,Bild W,Hritcu L,etal.Brain renin-angiotensin system in cognitive function:pre-clinical findings and implications for prevention and treatment of dementia〔J〕.Acta Neurol Belg,2009;109(3):171-80.

4 黄新武,李 华,秦大莲，等.不同时点分别结扎左、右颈总动脉建立大鼠血管性痴呆模型〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(14)：2006-7.

5 Saavedra JM.Angiotensin Ⅱ AT(1)receptor blockers as treatments for inflammatory brain disorders〔J〕.Clin Sci(Lond),2012;123(10):567-90.

6 Lanz TV,Ding Z,Ho PP,etal.Angiotensin Ⅱ sustains brain inflammation in mice via TGF-beta〔J〕.J Clin Invest,2010;120(8):2782-94.

〔2016-04-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

黄新武(1972-)，男，副教授，硕士，硕士生导师，主要从事脑血管疾病和神经药理相关研究。

李蓓华(1991-)，女，在读硕士，主要从事神经药理相关研究。

R96

A

1005-9202(2017)14-3423-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.018

1 西昌市人民医院