姬松茸多糖对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响

王苏亮 张淑英 曲 影 霍 梅 周 虹

(齐齐哈尔医学院附属第二医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)



姬松茸多糖对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响

王苏亮 张淑英 曲 影 霍 梅 周 虹

(齐齐哈尔医学院附属第二医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 观察相对低分子量姬松茸多糖(LMPAB)对急性单核细胞白血病THP-1 细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用4个浓度梯度的LMPAB分别对体外培养的THP-1细胞进行干预，然后应用水溶性四唑盐法(WST-1)检测LMPAB对细胞增殖的影响，借助膜联蛋白 V/7氨基放线菌素AnnexinV/7-AAD，双标记法分析细胞凋亡情况，分别采用PCR与Western印迹检测Bax和Caspase-3 信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达变化。结果 WST-1检测结果显示，LMPAB对THP-1 细胞的增殖具有抑制作用，且大体呈现剂量依赖性(P<0.05)；Annexin V/7-AAD检测结果显示，LMPAB具有促进THP-1 细胞凋亡的作用，且大体呈现剂量依赖性(P<0.05)；PCR与Western印迹检测结果显示，LMPAB各剂量组均可以增强Bax和Caspase-3的mRNA与蛋白表达且大体呈现剂量依赖性(P<0.05)。结论 LMPAB能够调控白血病THP-1细胞时增殖和凋亡，其抗肿瘤效应可能通过调控线粒体途径实现。

姬松茸多糖；THP-1；凋亡

急性单核细胞白血病是一类血液系统的非实体性恶性肿瘤，属于人急性髓系白血病的一种特殊亚型，临床治疗主要以药物化疗、骨髓移植治疗和支持治疗为主，但治疗效果均不理想，缓解率低、预后较差、容易复发〔1,2〕。研究表明，姬松茸的抗肿瘤作用疗效显著，是抗肿瘤大型蕈菌的代表菌属，姬松茸的抗肿瘤活性较强，目前认为其抗肿瘤的主要活性成分是多糖〔3〕。THP-1细胞株源于1岁急性单核白血病患儿，是经典的急性单核白血病细胞株也是研发新药物和制定治疗新方案的重要媒介〔4〕。本文旨在探讨LMPAB 对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 LMPAB 由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取，分子量约48 000 kD，实验时用无血清DMEM培养基配成相应浓度，经过滤除菌后 4℃保存备用；RPMI1640 培养基与胎牛血清购于Hyclone公司(Lot:NY00834，NWC0389)，WST-1购于Millipore公司(Lot:2092649)；TRIzon Reagent 总RNA提取试剂盒和Prime Script RT reagent Kit均为TaKaRa公司产品(Lot:RR370A)，SYBR Premix Ex Taq购于TaKaRa公司(Lot:RR420A)。人急性单核细胞白血病细胞系THP-1 细胞由院本部细胞库保存。

1.2 细胞增殖检测 取对数生长期的THP-1细胞，经过计数后，将其以密度2×104/ml接种于96孔板，每孔注入培养液100 μl(90%RPMI1640 培养基与10%胎牛血清)，培养24 h后加入WST-1 10 μl/孔，进行吸光度检测。分为：空白对照组、溶媒组及LMPAB 40、20、10、5 μmol/L 4个药物剂量组。

1.3 细胞凋亡检测 应用Annexin V/7-AAD检测空白对照组、溶媒组和4个药物剂量组细胞凋亡情况。取对数生长期THP-1细胞制成单细胞悬液接种于6孔板，加入Annexin V孵育，冲洗后重悬细胞，加入7-AAD，反应10 min，应用流式细胞仪检测。

1.4 PCR检测Bax和Caspase-3的mRNA表达 收集培养24 h的空白对照组、溶媒组和4个药物剂量组的细胞，首先进行RNA的纯度、浓度和完整性检测，然后借助Prime ScriptTMRT reagent Kit 反转录反应试剂盒进行逆转录反应。PCR反应引物由TaKaRa 公司设计合成，Bax上游引物:5'-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3'，下游引物:5'-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3'；Caspase-3上游引物:5'-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3'，下游引物:5'-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3'；GAPDH上游引物:5'-TCCAGTATGACTCTACCCACG-3'，下游引物:5'-CACGACATACTCAGCACCAG-3'。采用GAPDH作为内参基因，分别扩增Bax、Caspase-3和GAPDH 基因，得到阈循环值(Ct) 平均值，Bax和Caspase-3基因的荧光定量PCR检测结果以2-ΔΔCt值反应基因mRNA的相对表达量。

1.5 Western印迹检测Bax和Caspase-3的蛋白表达 收集各组细胞提取Bax和Caspase-3蛋白，进行测定和蛋白定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加抗，曝光，采集图像，应用 ImageJ2x 分析软件分析条带灰度，以目的基因条带与内参基因 GAPDH 的比值来表示Bax和Caspase-3蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行组单因素方差分析。

2 结 果

2.1 LMPAB对THP-1细胞增殖活性的影响 空白对照组增殖抑制率〔(0.708±0.017)%〕与溶媒组〔(0.695±0.010)%〕无明显差异(P>0.05)，LMPAB各剂量组的细胞活力明显降低，大体上呈现剂量依赖效应(P<0.05)，但LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 LMPAB对THP-1细胞凋亡的影响 AnnexinV/7-AAD检测结果显示，与空白对照组比较，溶媒组细胞凋亡率无明显降低(P>0.05)，LMPAB各剂量组细胞凋亡率明显升高，大体上呈现剂量依赖效应(P<0.05)，LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 LMPAB对THP-1细胞Bax和Caspase-3 mRNA表达的影响 PCR检测结果显示，与空白对照组比较，溶媒组Bax和Caspase-3 mRNA的表达无明显差异(P>0.05)，LMPAB各剂量组均明显升高，大体呈现剂量依赖效应(P<0.05)，LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。2.4 LMPAB对THP-1细胞Bax和Caspase-3蛋白表达的影响 Western印迹检测结果显示，与空白对照组比较，溶媒组Bax和Caspase-3蛋白表达无明显差异(P>0.05)，LMPAB各剂量组均明显升高，大体上呈现剂量依赖效应(P<0.05)，而LMPAB 20 μmol/L和40 μmol/L组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1。

表1 LMPAB对THP-1细胞凋亡、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的影响

与空白对照组比较：1)P<0.05

A：空白对照组；B：溶媒组；C～F：LMPAB 5、10、20、40 μmol/L组图1 各组THP-1细胞Bax和Caspase-3蛋白表达

3 讨 论

白血病是一种恶性克隆性血液系统疾病。我国以急性髓细胞白血病(AML)为主，其中急性单核细胞白血病FAB发病率高居AML的首位〔5〕。急性单核细胞白血病M5型具有治疗难度大，化疗效果差，耐药性高和易复发等特点〔6〕。

多糖是一种天然的高分子聚合物，具有显著的抗肿瘤活性且毒副作用较小，是一种潜在价值较高的新型抗肿瘤药物〔7〕。研究表明，LMPAB对肿瘤细胞的凋亡具有一定的调控作用〔8〕。细胞的凋亡调控途径分为“外在”和“内在” 两条调控途径。“外在”凋亡途径又称死亡受体途径，“内在”凋亡途径又称线粒体途径〔9〕。线粒体途径主要由Bcl-2 家族基因和Caspase家族共同参与。Bcl-2 家族基因表达的不同蛋白是调节凋亡的关键因子，该家族可分为抗凋亡因子和促细胞死亡因子，抗凋亡因子主要包括Bcl-2、W、XL和Mcl-1等，而促细胞死亡因子主要包括Bax、Bak和Bad等。Bax可从细胞质转移到线粒体，增加线粒体膜的通透性，释放细胞色素C入细胞质，激活Caspase-3并水解目标蛋白，从而导致细胞基质蛋白分解，引起细胞器膜破裂和细胞核分解，进而导致细胞凋亡〔10〕。

本研究结果说明LMPAB具有较显著的抑瘤效应且有较明显的剂量依赖效应，20 μmol/L和40 μmol/L组无明显差异，其原因可能是高剂量的LMPAB对细胞本身产生了抑制作用，其最佳剂量为20 μmol/L。另外本研究结果提示LMPAB的抑瘤

作用可能是通过增强Bax和Caspase-3的表达，增加线粒体膜的通透性，释放细胞色素C入细胞质，激活、水解目标蛋白，从而引起THP-1细胞器膜破裂和细胞核分解，进而导致THP-1细胞凋亡。说明LMPAB的抗癌作用可能是通过调控细胞凋亡的“内在”途径来实现。

1 吴碧涛，马婷婷，林 艳，等.IL-12诱导急性单核细胞白血病细胞分化及凋亡的机制研究〔J〕.中国细胞生物学学报,2015;37(5)：677-82.

2 Siegel R,Ma J,Zou Z,etal.Cancer statistics,2014〔J〕.CA Cancer J Clin,2014;64(1):9-29.

3 董海影，张 春，韩翠翠，等.低分子量姬松茸多糖对树突细胞Th1 型免疫反应的影响〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(3)：685-6.

4 Maryanovich M,Frenette PS.A time bomb for leukemia〔J〕.Cell,2016;165(2):262-3.

5 陈万青，单保恩，郑荣寿，等.2003～2007年中国肿瘤登记地区白血病发病与死亡分析〔J〕.肿瘤,2012;32(4)：251-5.

6 Benderra Z,Faussat AM,Sayada L,etal.MRP3,BCRP and P-glycoprotein activities are prognostic factors in adult acute myeioid leukemia〔J〕.Clin Cancer Res,2005;11(21):7764-72.

7 林 俊，李 萍，陈靠山.近5 年多糖抗肿瘤活性研究进展〔J〕.中国中药杂志,2013;38(8)：1116.

8 董海影，高志影，荣 华，等.姬松茸多糖对树突状细胞Dectin-1、Syk 及CARD9基因表达和T 淋巴细胞增殖的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2014;20(10)：180-3.

9 Matthews GM,Newbold A,Johnstone RW,etal.Intrinsic and extrinsic apoptotic pathway signaling as determinants of histone deacetylase inhibitor antitumor activity〔J〕.Adv Cancer Res,2012;116:165-97.

10 Kulikov AV,Shilov ES,Mufazalov IA,etal.Cytochrome c:the Achilles′heel in apoptosis〔J〕.Cell Mol Life Sci,2012;69(11):1786-97.

〔2016-07-19修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

齐齐哈尔市科技局社会发展项目(SFCG-201319)

周 虹(1966-)，女，硕士，主任医师，主要从事临床药物抗肿瘤研究。

王苏亮(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事临床药物抗肿瘤研究。

R285

A

1005-9202(2017)14-3413-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.14.014