怀牛膝茎叶多糖提取及生物活性

郭 宁，郭 婕

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001）

怀牛膝茎叶多糖提取及生物活性

郭 宁，郭 婕＊

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466001）

通过微波辅助提取和热水浸提两种方法，提取怀牛膝茎叶多糖.并测定样品提取液对农杆菌、大肠杆菌的抑菌作用，同时测定其对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率，研究其抗氧化活性.结果表明，微波辅助提取和热水浸提法对怀牛膝茎叶多糖提取率分别为103.79mg／g、89.58mg／g.微波辅助提取液对农杆菌及大肠杆菌抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为10mm、11mm.且样品提取液有明显的清除自由基活性，微波辅助法提取的多糖对超氧阴离子自由基的清除率为77.38%，对羟自由基的清除率为60.23%.

怀牛膝；茎叶；多糖；生物活性

牛膝作为一种中草药，具有“苦、酸、平，归肝、肾经”［1］的性质.中国的不同地区均有种植，主产于河南、四川，分别称为怀牛膝和川牛膝.牛膝多糖是从其根茎叶中提取的一种多糖，现代临床医学证实，牛膝多糖有提高免疫力、抑制肿瘤生长等功效［2－4］.牛膝多糖还具有分子量小、水溶性好、毒性低的优点，不但可以口服，还可以注射，将会成为一种很有前景的多糖药物.

目前对怀牛膝茎叶中的多糖研究比较少，导致怀牛膝茎叶不能合理利用而大量浪费，故笔者以怀牛膝的茎叶为材料，采用微波辅助提取和热水浸提两种方法研究怀牛膝茎叶多糖的含量；进一步研究怀牛膝多糖对常见致病菌大肠杆菌、农杆菌的抑制作用；并测定怀牛膝多糖提取液对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率，研究怀牛膝茎叶多糖的抗氧化活性.以期为更好地开发和利用怀牛膝茎叶多糖提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验所用仪器、材料及试剂

材料：怀牛膝茎叶，采于周口市公园内.

试剂：氯仿、正丁醇、乙醚、苯酚、盐酸、浓磷酸、双氧水、丙酮、乙醇、甲醇等.

主要仪器：分光光度计、万能粉碎机、电子天平、微波炉、循环水式真空泵、恒温振荡器、生化培养箱、不锈钢压力蒸汽灭菌器等.

1.2 怀牛膝茎叶多糖的提取及含量测定

以蒸馏水作为溶剂，提取怀牛膝茎叶多糖.采用苯酚－硫酸法［5］测定多糖的含量，以葡萄糖为标准品.

1.2.1 怀牛膝茎叶多糖的提取工艺流程

参照文献［6］并稍加修改，利用微波辅助法和热水浸提法提取怀牛膝茎叶中的多糖.

1.2.2 标准曲线的绘制

分别移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL浓度为100μg／mL的葡萄糖溶液，置于各个试管中，参照文献［7］测定多糖含量的常用方法并适当修改，490nm处测定吸光度，得标准方程式y＝0.027x－0.009，R2＝0.995.y为吸光度，x为葡萄糖浓度（μg／mL）.

1.3 怀牛膝茎叶多糖提取液的抑菌活性

1.3.1 活化菌种

在无菌工作台上把低温保存的菌种用移液管吸取一定量放入灭菌好的液体培养基里，把锥形瓶放在恒温摇床上过夜增殖.增殖大肠杆菌时恒温摇床的转速设定为180r／min，温度为37℃.增殖农杆菌时恒温摇床的转速设定为180r／min，温度为28℃.

1.3.2 抑菌液的制备

取适量的怀牛膝茎叶多糖提取液和蒸馏水放于小烧杯中，于紫外灯光下灭菌40min，然后取滤纸片在上述溶液中浸泡5min.

1.3.3 实验操作

将灭菌好的固体培养基倒入无菌培养皿中，水平放置待凝固.用无菌吸管吸取0.3～0.5mL菌悬液加入到凝固的培养皿上，用无菌三角涂布棒涂布均匀.将涂布好的培养皿分成3等份，在培养皿的下面用记号笔做标记.用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片置于每个培养皿对应的部位，一个用无菌水对照，另外两个为不同方法的多糖提取液.每个菌种做四个重复和一个空白对照.大肠杆菌和农杆菌分别置于37℃和28℃恒温培养箱中培养24h，观察是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈的直径.

1.4 怀牛膝茎叶多糖提取液的抗氧化活性

1.4.1 怀牛膝茎叶多糖对超氧阴离子自由基清除活性测定

参照文献［8］并稍加修改.

1.4.2 怀牛膝茎叶多糖对羟自由基清除活性测定

参照文献［9］并稍加修改.

2 结果与讨论

2.1 不同提取方法对怀牛膝茎叶多糖提取率的影响

实验采用微波辅助法和热水浸提法提取怀牛膝茎叶中的多糖，并以苯酚－硫酸法测定多糖的含量.由图1可以看出，微波辅助提取法对怀牛膝茎叶多糖的提取率较高，为103.79mg／g，热水浸提法的提取率为89.58mg／g.微波提取的原理［9］是物质吸收微波能，细胞内温度迅速上升，压力超过细胞壁膨胀承受能力使细胞破裂，使多糖流出.优点是提取时间短、提取率高、条件温和、不易破坏多糖的立体结构，从而保持其生物活性.而热水提取法所需温度一般较高，提取时间较长.

2.2 怀牛膝茎叶多糖提取液的抑菌活性

采用滤纸片法研究怀牛膝多糖对大肠杆菌、农杆菌的抑制效果，以抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小为指标，实验结果见表1.

图1 不同方法提取怀牛膝茎叶多糖

表1 抑菌圈直径／mm

通过观察培养24h之后的菌体发现，各培养基上均有明显的抑菌圈.表明怀牛膝茎叶多糖提取物对各实验菌株均表现出一定的抑制效果，但微波辅助浸提液要优于热水提取液.

2.3 怀牛膝茎叶多糖提取液的抗氧化活性

由图2、图3可知，提取的怀牛膝茎叶多糖对超氧阴离子和羟自由基均有良好的清除效果.微波辅助法提取的多糖对超氧阴离子自由基的清除率为77.38%，对羟自由基的清除率为60.23%.热水浸提法提取的多糖对超氧阴离子自由基的清除率为48.24%，对羟自由基的清除率为39.45%.正常情况下，体内维持自由基代谢的平衡对于防止疾病的发生和保持机体的健康是十分有益的.

图2 怀牛膝茎叶多糖提取液对超氧阴离子自由基的清除率

3 结论

微波辅助法对怀牛膝茎叶多糖的提取率较高，为103.79mg／g.怀牛膝茎叶多糖提取液对农杆菌及大肠杆菌有一定的抑菌活性.微波辅助浸提液的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为10mm、11mm.怀牛膝多糖具有明显的抗氧化活性，微波辅助法多糖提取液的自由基清除活性较好，对超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率分别为77.38%和60.23%.

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005：49.

［2］李祖伦，石圣洪，陈红，等.川牛膝多糖的免疫活性研究［J］.中药材，1998，21（2）：90－92.

［3］宋军，杨金蓉，李祖伦.川牛膝多糖对小鼠肝癌细胞抑制作用研究［J］.四川生理科学杂志，2002，24（3）：118－119.

［4］陈红，刘友平.川牛膝多糖抗肿瘤作用初探［J］.成都中医药大学学报，2001，24（1）：49－50.

［5］徐光域，颜军，郭晓强，等.硫酸-苯酚定糖法的改进与初步应用［J］.食品科学，2005，26（8）：342－346.

［6］郭婕，胡春红，袁淑培，等.车前草多糖微波提取工艺研究［J］.食品工业科技，2014，35（16）：223－225，230.

［7］李玲，陈常秀.大枣多糖的分离及抗氧化性研究［J］.食品研究与开发，2009，30（9）：49－51，64.

［8］聂凌鸿，宁正祥.广东淮山水溶性多糖的分离纯化及体外抗氧化活性的研究［J］.食品科学，2003，24（11）：129－133.

［9］刘青梅，杨性民，邓红霞，等.采用微波技术提取紫菜多糖的工艺研究［J］.农业工程学报，2005，21（2）：153－156.

Study on the polysaccharide extraction from stems and leaves of Achyran thes b iden tata Bl.and its bioactivity

GUO Ning，GUO Jie
（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

The polysaccharide was extracted by microwave-assisted and hot-water extraction from stems and leaves of Achyranthes bidentata Bl..The antibacterial effects on bacterials such as Agrobacterium tumefacien and Escherichia coli were detected.At the same time，the antioxidant activity of the extracts was detected.The results showed that the extraction ratio of the polysaccharide through microwaveassisted and hot-water extraction were 103.79mg／g and 89.58mg／g，respectively.It was also found that microwaveassisted extracts had better inhibition effects on Agrobacterium tumefacienand Escherichia coli with 10mm and 11mm respectively of the inhibition zone diameter for the two bacterials.And the microwave-assisted extracts had obvious antioxidant activity with the clearance rate of 77.38%for superoxide anion radical and 60.23%for hydroxyl radical.

Achyranthes bidentata Bl.；stems and leaves；polysaccharide；bioactivity

R284.2

A

1671-9476（2017）02-0120-03

10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.030

2016-11-28；

2016-12-23

2015年河南省高等学校重点科研项目（No.15A180065）

郭宁（1985－），女，河南周口人，助教，硕士，主要从事植物分子生物学研究.

＊通信作者简介：郭婕（1984－），女，河南周口人，讲师，硕士，主要从事天然药物化学研究.

图3 怀牛膝茎叶多糖提取液对羟自由基的清除率