母乳中微生物及在婴儿免疫系统启动与发育中的作用

荫士安

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

[专家论坛]

母乳中微生物及在婴儿免疫系统启动与发育中的作用

荫士安

(中国疾病预防控制中心营养与健康所，北京 100050)

母乳除了为新生儿和婴儿提供最佳的营养，而且还是从母体转运细菌和病毒到婴儿的载体；尤其是初乳中富含微生物,通过母乳喂养让新生儿和婴儿暴露母乳中含有的多种微生物,刺激新生儿和婴儿的肠道免疫功能。人乳中微生物的来源主要集中在污染学说和进化学说两个方面，越来越多的证据支持人乳中含有的微生物来源于环境污染之外的途径，即母亲肠道中的细菌通过内源性途径迁移到乳腺(肠道-乳腺途径)，再通过哺乳进入婴儿体内。健康乳母的各阶段乳汁中均含有丰富的微生物，且种类复杂；人乳中微生物成分具有明显的宿主依赖性，不同个体的母乳中微生物种类差异明显，即使是同一产妇，其母乳中微生物组成和数量也呈现动态变化。母乳喂养有助于婴儿肠道益生菌群的生长与定植，母乳中含有的多种活菌和游离的细菌DNA印迹在新生儿内源性免疫系统激活过程、编程新生儿的免疫系统、肠道免疫功能发育成熟及降低疾病易感性轨迹方面发挥关键作用。人乳中的微生物与多种具有免疫活性细胞和可溶性免疫活性成分等共同协调促进新生儿和婴儿肠道的发育、免疫功能的启动与成熟，而剖宫产则影响新生儿肠道菌群的定植。每个母亲应该用自己最珍贵的乳汁喂哺婴儿。

母乳喂养；初乳；微生物；新生儿；婴儿；免疫系统

母乳是复杂的液体，除了为新生儿和婴儿提供了最佳的营养和多种天然抗感染成分，而且还是从母体转运细菌和病毒到婴儿的载体，人乳是母乳喂养儿胃肠道细菌的主要来源，或被称为婴儿的天然原型益生菌食品[1]。初乳中含有丰富的微生物,通过母乳喂养让新生儿和婴儿暴露母乳中含有的微生物,刺激新生儿和婴儿的肠道免疫功能，在肠道免疫系统发育与功能成熟[2-6]及降低疾病易感性轨迹方面发挥重要作用[7]。消化道不仅是营养素消化吸收的器官，还是主要的内分泌、神经和免疫功能器官[8]。尽早给予新生儿初乳和持续纯母乳喂养婴儿到6个月，是保护儿童生命的最经济有效的方法，而且还会对乳母和喂养儿的健康状况产生诸多短期和长期有益影响[9]。

1人乳中微生物的来源

有关人乳中微生物的来源一直备受争议，主要集中在传统假设(污染学说)和主动迁移理论(进化学说)[10]两方面。

1.1传统假设(污染学说)

新鲜人乳中是否含有微生物？至今传统观念、大多数医学或营养学教科书中仍然认为母乳本身是无菌的，微生物在人体内的定植出生时才开始[11-13]。已有证明人乳是婴儿肠道中共生菌和潜在益生菌的良好和连续来源[14]。人乳中之所以含有细菌，是喂哺过程中产妇/乳母的皮肤和婴儿口腔内含有的微生物污染了乳房/母乳，或污染了乳头的微生物，随婴儿吸吮过程(负压)沿乳腺管转移到乳腺，存在婴儿口腔与乳腺的细菌交换[15]，而新生儿口腔/体内的细菌则是分娩过程中，新生儿受到产妇肠道和阴道内微生物的污染[16]或分娩过程导致母体肠道和阴道中存在的菌群至婴儿肠道的自然“迁移”过程[17]，即传统假设“污染学说”(the traditional hypothesis:‘a contamination hypothesis’)。

然而，这一说法很难解释为什么从母乳中能分离出严格厌氧的双歧杆菌，而且初乳中也能分离出多种细菌[18]；从婴儿粪便中检出的乳酸杆菌与乳母阴道的乳酸杆菌菌群不同[16]；从人乳中分离的乳酸杆菌属、肠球菌和双歧杆菌遗传型与从皮肤表面分离的菌群不同或检不出[19-22]。越来越多的证据支持这样的假设，即人乳中存在的细菌不仅仅是污染的结果。首先，双歧杆菌是严格的厌氧菌，这使得它很难从婴儿口腔迁移到乳房皮肤[23]；第二，在婴儿出生前就可以从初乳中分离出细菌；第三，给乳母口服含有活菌的胶囊，乳汁中可以检测到该种补充的益生菌[24-25]。

1.2主动迁移理论(进化学说)

近年来，越来越多的研究证据支持人乳中微生物不是污染物，人乳中含有的微生物来源于环境污染之外的途径[26]，即母亲肠道中的细菌通过内源性途径迁移到乳腺-肠道乳腺途径，再通过哺乳过程进入婴儿体内，并定植在喂养儿的胃肠道[17,24,27-29]，即主动迁移理论(进化学说)”(the revolutionary hypothesis:‘active migration’)。

采用组织培养和分子生物学技术，通过动物实验和人群干预试验获得的结果支持母亲肠道中细菌可通过内源性途径迁移到乳腺，树突状细胞和巨噬细胞参与了这个迁移过程[12，30-32]，也有研究提示来自母体胃肠道的某些细菌通过涉及单核免疫细胞机制迁移到乳腺[33]。通过比较人乳、产妇粪便、婴儿粪便和母亲外周血中单核细胞中发现的细菌DNA印迹，结果是相同的，提示细菌可能是通过血液循环被转运，肠源性细菌或细菌成分能够在单核细胞内被转移到哺乳期的乳腺，而且已经证明健康人血液中存在细菌[34-35]，在几乎所用采取的活体乳房组织中均检测出活菌，而相应的采样环境中没有分离出来这样的细菌菌株[36]；采用培养基培养的方法，已经在假设无菌采集的人乳样品中证实了细菌的存在。采用16s rDNA测序技术的结果显示，母乳是婴儿肠道乳酸菌的主要来源，乳汁中存在的乳酸菌是母体内源性来源，而不是来自乳房周围皮肤的污染[20]。

1.3有待解决的问题

上述的研究结果提示，存在母体肠道中的细菌通过内源性途径迁移到乳腺的过程，但是这种“迁移假说”的如下几个方面还有待证明：①目前还不十分清楚乳母肠道内的细菌如何与免疫细胞相互作用以及被转运到乳腺，细菌通过什么样机制躲避被宿主先天免疫细胞吞噬和被杀死。推测妊娠与哺乳期多种激素水平的变化可能对体内细菌的迁移发挥了重要作用。②细菌发生迁移过程是否存在一个“机会窗口期”？Donnet-Hughes等[37]研究结果显示，分娩后1天细菌就可从肠系膜淋巴结迁移到乳腺。但是，还不清楚迁移过程开始和结束的时间，以及限制或影响这个时期迁移的因素。③母体内迁移过程对细菌的选择性。最初人们认为，某些菌株可以被免疫细胞识别并被转运到乳腺，而有些则不能被转运。尽管所有的细菌都能被免疫细胞识别，但是有些菌株可能具有躲避免疫细胞吞噬或被杀死的能力。这还需要进一步研究细菌的存活能力或吸附到免疫细胞表面的停留时间与其从母体肠道迁移到乳腺的关系。④人乳中微生物的来源可能包括母体内来源(肠道-乳腺转运途径)和哺乳期间乳房暴露的细菌(婴儿口腔、乳房皮肤、衣服等)[11]，因此需要研究两者对婴儿肠道微生物的贡献和影响因素及对婴儿健康状况的近期和远期影响。

2人乳中微生物的种类与数量

健康乳母的各阶段乳汁中均含有丰富的微生物，且种类复杂[18,38]。人乳中的微生物，如人类微生物组中任何其他生态环境一样，并不是一个孤立的环境，而是一个相互关联、相互依存的网络体系[39]。因此，从生态学角度，全面系统地研究母乳中微生物菌落结构的多样性和稳定性具有重要意义。

2.1人乳中已经发现的微生物

经培养基培养无菌采集的人乳样品，证实人乳中存在的菌属包括葡萄球菌、链球菌、乳球菌属、明串珠菌属、魏斯氏、肠球菌、丙酸菌属、乳酸杆菌和双歧杆菌、假单胞菌属等[11-12,21,40]。人乳中分离出来的最常见细菌菌属包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、轻型链球菌、唾液链球菌、唾液乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、加氏乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、短双歧杆菌和双歧杆菌。人乳中微生物菌群特征的系统综述数据显示，人乳中普遍占主导地位的微生物是链球菌和葡萄球菌，而且与地理位置或分析方法的差别无关[40]。

2.1.1 DNA二代测序技术的研究结果

母乳中微生物菌落存在多样性和随时间变化相对稳定的特征，母乳中含量最丰富的菌属是葡萄球菌属、金黄色葡萄球菌属、链球菌属，还有乳酸杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属和明串珠菌属等普遍存在于母乳中[21]。Martin等[41]还从健康人乳中分离出一种新的细菌，即乳链球菌。短双歧杆菌也被证明是人乳中最常见的一种益生菌[42-44]。短双歧杆菌菌株UCC2003可产生一种胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)，EPS阳性的菌株可降低肠道病原体的定植。

2.1.2应用454焦磷酸测序的16S核糖体RNA(rRNA)基因编码扩增技术

可深入分析人乳中细菌菌落，评估人乳中细菌的多样性[14,16,19,21-22]。在Hunt等[21]的研究中，从16名健康妇女中各采集3个乳样进行分析，所有样品中均存在9个菌属(链球菌属、葡萄球菌属、沙雷氏菌属、假单胞菌属、棒状杆菌、青枯菌属、丙酸菌属、鞘氨醇单胞菌属和慢生根瘤菌属)，占观察到的人乳中微生物菌落的一半；链球菌和葡萄球菌与沙雷氏菌属一起是人乳中代表性的主要菌属，所检索的16S rRNA基因序列超过5%；而其他8个菌属仅占整个样品观察到菌群的≥1%。然而，与其他的研究相反，Hunt等[21]的人乳微生物研究中未检出乳酸杆菌，也未发现双歧杆菌。这些差异可能是由于社会经济、文化、遗传及抗生素使用的差异和膳食差异引起的，因为这些研究是在欧洲和美国完成，造成这样差异的原因还可能由于研究细菌菌落的分子生物学技术的限制[45-48]。这些研究结果说明，在人乳中含有细菌的多样性超过以前的假设，提示如同人体其它部位的细菌菌群一样，人乳中也可能存在一个“核心”微生物群(core microbiome)[49-50]。这些研究通过依赖培养基的技术，证实了人乳中细菌菌群的存在，同时也揭示了其它细菌菌群的存在，包括某些革兰阴性菌[14,21]。目前已经从人乳中分离出的细菌种类超过了200多种。近年来通过现代分子生物学技术进一步确定了母乳中存在微生物的多样性与复杂性[16-22，28，30，38，41-42，44，51-55]。

随着焦磷酸测序或宏基因组学技术的日趋完善和广泛应用，单细胞培养和测序技术已应用于细菌细胞的分离和鉴定，人们期待发现人乳中存在的更多“稀有”的细菌菌种[21]，将能更深入地了解人乳中微生物成分和功能及对母乳喂养婴儿营养与健康状况的近期和远期影响。

2.2影响人乳中微生物种类与数量的因素

尽管人乳中含有丰富的细菌，然而，人乳中微生物成分具有明显的宿主依赖性[21]，不同个体的母乳中微生物种类差异明显，即使是同一产妇其母乳中微生物菌群的组成和数量也呈现动态变化；而且在单一人乳样品中可培养出细菌菌株的数量要低得多(218个不同菌种)。乳汁或乳腺中存在的细菌菌落与稳态持续受乳母或其婴儿暴露环境中微生物的影响，也受乳母健康状态的影响；母乳中菌群构成差别也可能与母乳样品采集时间和采集的个体差别以及样品贮存和分析方法有关[21,26,40,42]。除了乳母的健康状况，影响母乳中微生物的潜在因素还包括胎次、分娩方式、分娩年龄、乳母的膳食、地理位置(如城乡)及遗传背景的影响[6,26,56]。因此还需要深入研究，更好地了解健康状况和实际微生物菌群之间的关联及这些相关可能对母婴营养与健康的影响。

3人乳中微生物在新生儿免疫系统启动中的作用

人初乳中含有的微生物种类高达数百种，对母乳喂养的新生儿和婴儿具有许多营养与健康益处[57]。按照婴儿每天摄入约800mL母乳，吸吮乳汁的同时摄入约1×105～1×107的共生菌，母乳是婴儿肠道中潜在共生细菌的持续来源[20,53]。

3.1母乳喂养有助于婴儿肠道益生菌群的生长与定植

通过母乳喂养，可将微生物菌群由母体垂直转移给其喂养儿，这将有助于婴儿正处于发育肠道中益生菌群的建立与定植[58-59]。例如，在不同喂养方式健康婴儿肠道菌群定植过程及其与食物过敏关系的研究中，通过分析婴儿粪便，显示母乳喂养及持续时间在肠道菌群形成和食物过敏易感性方面发挥重要作用；母乳喂养儿的肠道中双歧杆菌增长迅速，生后第6天即成为优势菌，而大肠埃希菌数量较低；相比较，人工喂养儿生后第6天双歧杆菌仍不是优势菌；生后6个月母乳喂养婴儿的肠道益生菌(如乳酸杆菌、双歧杆菌)数量显著高于人工喂养儿，而大肠埃希菌数量则显著低于人工喂养婴儿；食物过敏婴幼儿肠道乳酸杆菌、双歧杆菌的数量显著低于健康婴幼儿，而大肠埃希菌数量则显著高于健康婴幼儿，提示益生菌群对过敏性疾病有预防作用[60-61]。

3.2初乳在启动新生儿肠道免疫中的作用

现代观点认为，人体免疫系统的启动和发育成熟与肠道微生物密切相关。母乳中含有的多种活菌和游离的细菌DNA印迹在新生儿内源性免疫系统激活过程(启动)、编程新生儿的免疫系统和肠道免疫功能发育,以及防止婴儿感染中发挥关键作用[6,12-13]。

3.2.1广谱抗菌和抗病毒作用

学者们很早就知道初乳含有的免疫刺激成分具有广谱抗菌抗病毒作用，母乳喂养可增加婴儿对某些感染的抵抗力，尤其是对肠道功能紊乱的抵抗力[4-5]。有研究观察到来自母体双歧杆菌和乳酸杆菌在婴儿肠道内的定植具有广谱抗菌和抗病毒作用，可以抑制病原微生物在婴儿肠道内定植生长，保护婴儿抗感染和促进免疫系统功能的成熟[12,17,31,62]。

3.2.2抗炎作用

早期母乳喂养，特别是初乳，一个重要的功能是为不成熟的、过度炎症反应的新生儿提供抗炎作用。因为新生儿的肠道免疫功能远未发育成熟，新生儿易患肠道及全身性感染。母乳中，尤其是初乳，含有丰富的微生物和生物活性成分，可刺激新生儿胃肠道启动免疫反应、促进免疫系统发育，降低炎症反应。母乳中这些成分可以单独或联合发挥抗炎作用[63]。体外试验结果显示，初乳抑制金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的活性相当于庆大霉素活性的1/2[64]。

3.3人乳在新生儿和婴儿免疫系统发育中的作用

人乳中的微生物与多种具有免疫活性细胞和可溶性免疫活性成分等共同协调促进新生儿和婴儿的肠道发育、免疫功能的启动与成熟。

3.3.1启动新生儿肠道免疫和促进免疫系统发育

新生儿免疫系统的发育成熟程度受经胎盘(胎儿期)和母乳转运母体免疫力(免疫活性成分)的影响。母乳喂养是婴儿接受的“第一次免疫”，有助于免疫器官的早期发育[65]。刚出生的新生儿免疫系统还未发育成熟，胃还没有能力清除病原体的能力，肠道也缺乏微生物菌落，尤其是益生菌的定植。人乳不仅含有对新生儿生长发育所需要的营养成分，而且还含有诸多有益于免疫系统发育成熟的益生菌、免疫活性成分或多种调节因子[5，66]，这些均可抑制肠道内致病菌的定植与生长，增强新生儿抗感染的能力[4-5]。

3.3.2参与机体的主动免疫及调节被动免疫

最近的临床调查和实验观察结果还表明，人乳不仅为新生儿和婴儿提供被动的免疫保护作用，还可以直接调节婴儿免疫系统的发育与成熟。在人乳提供被动保护和主动调节婴儿黏膜发育及系统免疫应答的能力方面，还与其含有的抗菌、抗炎和免疫调节活性物质的复杂混合物的相互协同作用有关[4-5,9]。在新生儿和婴儿期，母乳喂养提供的免疫活性成分可以保护其不成熟的免疫系统，例如，通过像妊娠期间免疫球蛋白G(IgG)的胎盘(从母体到胎儿)转运通道和通过母乳摄入的免疫活性成分(如乳铁蛋白、具有免疫功能的细胞成分、溶菌酶、细胞因子等)，为其提供防御感染的保护作用；母乳中含有的TGF对启动新生儿IgA的产生发挥重要作用[67]。母乳喂养可以使母体对胎儿的保护作用在其出生后得以延续，使有利于调节免疫系统的母体因子持续不断地向新生儿转移，而且母乳对这个时期儿童自身免疫能力的发育完善也是非常重要的[68]。

3.4剖宫产影响新生儿肠道菌群的定植

基于121个国家的统计数据显示，1990—2014间全球剖宫产率由6.7%上升到19.1%，年均增长4.4%[69]。我国剖宫产率也呈现明显上升趋势，1993—1994年约5%[70]，2001—2002年为20.4%[70]，2006年达到55.2%，2011年虽略有下降，但仍高达43.6%[71]，而且主要是无指征剖宫产[72]。

细菌在肠道的初次定植是新生儿经历的最明显的免疫暴露，也是影响健康和疾病风险的重要环境因素[73]。诸多研究结果显示，分娩方式与生后最初3个月婴儿肠道微生物的多样化和定植密切相关，自然分娩新生儿的肠道菌群主要来自母体产道和肠道菌群，而剖宫产的新生儿肠道菌群主要来自环境菌群[74-75]。自然分娩的婴儿肠道双歧杆菌和拟杆菌属的定植水平显著高于剖宫产的婴儿[76-79]；自然分娩过程中，从母体转移的几种双歧杆菌于婴儿生后不久即可定植在其肠道，母体肠道是自然分娩婴儿肠道微生物的重要来源[80]。健康的肠道菌群可促进婴儿免疫系统的发育与成熟，而异常的肠道菌群则是婴儿期患严重胃肠感染的主要原因[76]，剖宫产与免疫介导性疾病可能存在关联[78]，而且这些婴儿过敏性疾病的发生率也较高[81-82]。因此应倡导和促进自然分娩，降低剖宫产率。

综上所述，母乳的优点已得到公认，早开奶并用纯母乳喂养婴儿到6个月，有助于启动新生儿的肠道免疫功能，促进免疫器官发育，降低腹泻及肺炎等相关感染性疾病的发病率和死亡率，尤其是在卫生条件较差的农村地区，母乳喂养对保护婴儿的健康和生存尤为重要。因此每个母亲应该用自己最珍贵的乳汁喂哺婴儿。

致谢：本稿件是国家科技部高技术研究发展计划(863计划)《促进生长发育的营养强化食品的研究与开发》课题的组成部分，课题编号2010AA023004。

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[专业责任编辑：刘黎明]

Microorganisms in breast milk and their roles in initiation and development of early immunization in infants

YIN Shi-an

(Institute of Nutrition and Health, Chinese Center for Disease Prevention and Control, Beijing 100050, China)

Breast milk not only provides optimal nutrition for neonates and infants but is a vehicle for transmission of bacteria and viruses from mother to her baby. Colostrum especially is rich in microorganisms and breastfeeding makes neonates and infants exposed to microorganisms contained in breast milk, which stimulates intestinal immune function of neonates and infants. Sources of microorganisms in human milk are mainly based on two hypotheses, contamination hypothesis and active migration hypothesis. There is growing evidence supporting that microorganisms contained in human milk are not from environmental pollution but from migration of bacteria from mother’s intestine to mammary gland through endogenous pathway (pathways of intestine to mammary gland) and entering infants through breast feeding. Healthy human milk is rich in microorganisms at various stage and species are rather complex. Microorganisms components in human milk have obvious host dependence and microbe species in different individuals are obviously different. Microbe composition and quantity in breast milk of same mother also has dynamic changes. Breastfeeding contributes to growth and colonization of probiotics in infant’s intestine tract. Breast milk contains multiple live bacteria and free bacterial DNA imprints, playing key role in activating innate immune system, programming neonatal immune system, developing intestine immune function and reducing susceptibility trajectory to infectious diseases. Microorganisms in human milk work in coordination with variety of immunocompetent cells and soluble immune active ingredients in promoting neonatal intestinal development, and initiation and maturation of neonatal immune function. But cesarean section affects colonization of intestinal flora in neonates. Every mother should feed baby with breast milk.

breastfeeding;colostrum;microorganism;neonates;infants;immune system

荫士安，中国疾病预防控制中心营养与健康所研究员，生命科学会东南亚婴幼儿营养专家委员会委员；第五届和第六届中国营养学会妇幼营养分会主任委员(2010—2012年)；卫生部食品法典专家组特殊膳食用营养与食品组成员(2002—2011年国际食品法典特殊营养与膳食分会中国代表团团长)；中国食品科学技术学会理事；中国食品科学技术学会儿童食品分会常务理事、中国老年学和老年医学会营养食品分会副主任委员等。1997年入选国家“百千万人才工程”，同年获国务院政府特殊津贴。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.06.001

R174

A

1673-5293(2017)06-0619-06

多年从事妇幼营养、营养素利用率和需要量的生物化学研究。获得多项国家级及省部级科研成果，“人体硒需要量及安全摄入量范围的研究”获1991年国家科技进步二等奖和1990年卫生部科技进步一等奖；国家“九五”攻关课题“微量营养素补充对孕妇健康及胎儿和儿童生长发育的影响”获2002年中华医学二等奖，2012年获浙江省科技进步二等奖等。

近10年来，国内外公开发表论文约150篇，主编论著和译著6部，主持编写和制订中国营养学会妇幼膳食指南，参与编写的论著有《中国居民膳食营养素参考摄入量-2000》，2013年；《中国营养百科全书》妇幼营养部分主编之一，2004年；主编科普论著约10册；主编《中华医学百科全书》人群营养部分,参与编写《国家的学生饮用奶计划研究报告》-2008，主编人乳成分-2016。