Anti-CD11b单克隆抗体对超高分子聚乙烯磨损颗粒诱导骨溶解作用的研究

杨国曦 朱庆生 杨重飞

第四军医大学附属西京医院骨一科, 陕西 西安 710032

人工关节置换术是本世纪发展最成功的术式之一，然而，无菌性松动造成的术后翻修给患者造成生活质量的下降和经济负担[1]。作为人体内唯一具有骨吸收功能的细胞，破骨细胞对骨量的维持以及骨形态的塑造具有非常重要的作用[2-4]。假体磨损而产生的磨损颗粒可以促进破骨细胞的分化，造成假体周围骨溶解，进一步发展则会引起无菌性松动的发生，并最终导致翻修，因此，研究破骨细胞分化的机制对无菌性松动的预防和治疗具有十分重要的意义。破骨细胞由单核/巨噬细胞分化而来，其分化成熟的过程亦是细胞迁徙和融合的过程，巨噬细胞分化抗原-1(Macrophage differentiation antigen-1，Mac-1)分子作为整合素家族的重要一员，除了参与免疫应答和炎症反应，也参与细胞间识别和信号转导[5]。与Mac-1(CD11b/CD18)分子仅有一个亚基之差的LFA-1(CD11a/CD18)和血管内皮细胞表达的ICAM-1(CD54)的相互作用对破骨细胞的分化具有明显的促进作用[6-8]，而目前尚无Mac-1在RANKL诱导下破骨细胞导致骨溶解的相关研究，因此，本实验将通过建立超高分子聚乙烯磨损颗粒诱导的小鼠颅骨溶解模型，模拟无菌性松动的发生过程，并探讨CD11b分子在颅骨溶解过程中发挥的作用及初步分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂及仪器

C57BL/6J清洁级小鼠，10周龄，由第四军医大学实验动物中心提供。鲎试剂内毒素快速检测试剂盒(Endosafe，美国)；超高分子聚乙烯(Ultrahigh molecular weight polyethylene，UHMWPE)磨损颗粒颗粒由德国ErnstKrendlinger教授惠赠(CeridustVP3610，Clariant，Gersthofen,Germany)50%的颗粒直径小于5 μm，90%的颗粒直径小于9 μm，平均直径为1.68±1.32 μm；小鼠TNF-α ElISA试剂盒(R&D，美国)；anti-CD11b单克隆抗体(M1/70，Abcam，美国)，Syk抑制剂(P505-15,Selleck，美国)。显微计算机体层摄影(General Electric Company，美国)；注射器；常规手术器械(手术刀、剪血管钳等)。

1.2 方法

1.2.1动物模型建立：术前将UHMWPE磨损颗粒用700 mg/L乙醇洗涤24 h，采用鲎检验排除细菌内毒素水平超标，磷酸盐缓冲液洗涤3遍，干燥后用Co60照射消毒，并用PBS溶液稀释为40 μg/mL悬浊液。

取10周龄雌性C57BL/6J小鼠32只，分为4组，每组8只，称量体重并做标记。10%水合氯醛麻醉，经外耳根内侧部连线的中点和眼眶后部连线的中点之间连线作矢状位切口长约 1.5 cm，暴露额状缝及人字缝间直径约 1 cm 的颅顶骨面积，并保持骨膜完整性。空白对照组(A)随即缝合不做任何处理(假手术组)；其余三组以暴露的矢状缝中点为中心，在颅骨骨膜外移植20 μg UHMWPE磨损颗粒(0.5 mL 浓度为40 μg/mL的颗粒PBS悬浊液)，随后间断缝合。术后待小鼠清醒后送入饲养笼中，动物自由摄取食物和水，饲养于清洁动物房中。术后第二天开始进行药物干预：空白对照组(A)灌胃生理盐水，37.5 ml/kg，每日两次，并尾静脉注射PBS，10 ml/kg，每日1次；Syk抑制剂组(B)以灌胃针头灌胃Syk抑制剂(P505-15)，15 mg/kg(浓度为0.4 mg/mL的P505-15生理盐水溶液)，每日两次，并尾静脉注射PBS，10 ml/kg，每日1次；anti-CD11b单克隆抗体组尾静脉注射anti-CD11b单抗，2 g/kg[9](浓度为200 mg/mL的抗体PBS溶液)，每日1次，并灌胃生理盐水，37.5 ml/kg，每日两次；颗粒组(D)灌胃生理盐水，37.5 ml/kg，每日两次，并尾静脉注射PBS，10 ml/kg，每日1次。2周后，颈椎脱臼法处死小鼠，摘眼球取血，取出颅骨标本。血液离心后用TNF-αELISA试剂盒检测TNF-α浓度，颅骨标本进行显微CT扫描重建并检测相同部位等面积感兴趣区域(region of interest，ROI)的骨体积分数(bone volume fraction，BVF)，若BVF值低于空白对照组(P<0.05)，并具备明显的骨溶解征象，则判定为建模成功。

1.2.2Western blot 分析：提取各组颅骨骨膜总蛋白。依次进行蛋白定量、电泳、转膜和封闭，分别孵育兔抗小鼠一抗(1∶1 000)及羊抗兔二抗(1∶5 000)后，ECL发光液化学发光并显影。采用Image J软件进行扫描定量，计算各条带灰度值，并分别除以内参β-actin灰度值，并将对照组设为参照。

2 结果

2.1 小鼠血清TNF-α浓度

空白对照组、anti-CD11b单克隆抗体组及Syk抑制剂组血清TNF-α值均低于颗粒组(P<0.05)。见表1。

2.2 显微CT三维重建

建模小鼠全部存活，平均体重26.6 g。空白对照组图像可见完整颅骨，未见颅骨溶解迹象；Syk抑制剂组骨溶解程度较颗粒组轻，只出现小部分缺损；anti-CD11b单克隆抗体组出现轻微颅骨溶解及骨缺损；颗粒组出现严重颅骨溶解，出现大面积缺损。见图1。

组别(Group)浓度(μg/mL)(Concentration:μg/mL)空白对照组(Control)1.025±0.002Syk抑制剂组(Syk inhibitor group)1.145±0.003a,bAnti-CD11b单抗治疗组(Anti-CD11b antibody group)1.202±0.002a,b颗粒组(Particles group)1.478±0.006a

注：a：与空白对照组相比结果具有统计学差异(P<0.05)；b：与颗粒组相比结果具有统计学差异(P<0.05)
a：P<0.05vscontrol,b:P<0.05vsparticles group

图1 小鼠颅骨溶解模型显微CT三维重建结果(圆形红色区域为ROI)A：空白对照组; B：Syk抑制剂组; C：Anti-CD11b单克隆抗体组; D：颗粒组Fig.1 Micro—CT three-dimensional reconstruction of mouse osteolysis model (red circular area areas refer to ROI)A:Control, B:Syk inhibitor group, C:Anti-CD11b antibody group, D:Particles group

2.3 小鼠颅骨骨体积分数

颗粒组骨体积分数小于空白对照组(P<0.05),可知超高分子聚乙烯颗粒诱导的小鼠颅骨溶解模型建模成功；Syk抑制剂组、anti-CD11b单克隆抗体组骨体积分数大于颗粒组(P<0.05)，可知Syk抑制剂及anti-CD11b单克隆抗体均对颗粒诱导的颅骨溶解有一定的抑制作用。见表2。

2.4 western blot 分析

Syk抑制剂组及anti-CD11b单克隆抗体组Erk活性、c-fos及NFATc1表达均低于颗粒组而高于空白对照组(P<0.05)。见图2，表3。

组别(Group)N骨体积分数(Bone volume fraction)空白对照组(Control)80.1402±0.0012Syk抑制剂组(Syk inhibitor group)80.1135±0.0009a,bAnti-CD11b单抗治疗组(Anti-CD11b antibody group)80.0902±0.0010a,b颗粒组(Particles group)80.0602±0.0008a

注：a：与空白对照组相比结果具有统计学差异(P<0.05)；b：与颗粒组相比结果具有统计学差异(P<0.05)
a：P<0.05vscontrol,b:P<0.05vsparticles group

图2 Western blot 结果Fig.2 Western blot results

表3 Western blot 半定量结果Table 3 Western blot semi-quantitative results

注：a：与空白对照组相比结果具有统计学差异(P<0.05)；b：与颗粒组相比结果具有统计学差异(P<0.05)，Erk: extracellular signal-regulated kinas,细胞外信号调节激酶,NFATc1: nuclear factor of activated T-cells-1,活化T细胞核因子1。
a：P<0.05 vs control,b:P<0.05 vs particles group，Erk: extracellular signal-regulated kinas，NFATc1: nuclear factor of activated T-cells-1.

3 讨论

无菌性松动可引起关节置换术后疼痛和功能障碍，并最终导致翻修，是人工关节置换术后最重要的慢性并发症之一[10]。尽管无菌性松动的发生受多种因素的影响，但磨损颗粒依然是其最重要的起始原因[11]，金属对UHMWPE是目前人工关节假体摩擦界面中最主要的一种，所产生的UHMWPE磨损颗粒也是临床上最常见的磨损颗粒之一[10]，在无菌性松动的病理发展过程中，磨损颗粒刺激多种细胞因子的分泌，例如TNF-α、IL-1和IL-6，进而促进破骨前体细胞的募集、分化、激活和存活，导致假体周围骨溶解的发生[10]，最终降低假体生存率。

CD11b是构成Mac-1分子的两种亚基之一[12-14]，而位于破骨前体细胞表面的Mac-1分子具有多种功能：第一，介导白细胞与NK细胞的游走与渗出；第二，介导白细胞与NK细胞对iC3b调理的微生物或靶细胞的细胞毒功能；第三，结合胞外多种糖蛋白分子，介导跨膜传导，影响破骨细胞的分化[15]。在Mac-1介导的细胞粘附和信号传导中，CD11b亚基起到主导作用，而不是另一亚基CD18[16]，因此推测anti-CD11b单克隆抗体可能影响颗粒诱导骨溶解的病理过程。在破骨细胞分化的初期阶段，Mac-1介导的信号转导在破骨前体细胞分化至抗酒石酸磷酸酶阳性及细胞迁徙到融合阶段都具有非常重要的作用[17]，该分子通过胞浆部分免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)调节衔接蛋白DAP(DNAX-activating protein，DNAX活化蛋白)12 和FcRγ(Fc receptorγ，Fc受体γ)传递信号激活Syk通路，从而进一步激活Ca2+信号，上调NFATc1转录因子，促进破骨细胞的形成[18]。本实验中anti-CD11b单克隆抗体组及Syk抑制剂组骨体积分数较颗粒组高，说明anti-CD11b单克隆抗体及Syk抑制剂对颗粒诱导的骨溶解具有抑制作用，而western blot结果显示anti-CD11b单抗或Syk抑制剂处理均导致Syk下游Erk通路相关蛋白表达下调，说明CD11b分子通过激活下游Syk通路促进破骨细胞分化。

TNF-α是由单核细胞、巨噬细胞以及T细胞分泌的一种细胞因子，病原体、内毒素等物质可以刺激该因子的产生。在骨代谢和炎症性骨病中，TNF-α促进破骨细胞的分化和存活，扮演着十分重要的角色。Christine Lau等[19]发现，Syk通过调控p38的磷酸化，参与核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)转录因子的激活，最终促进TNF-α的分泌，在炎症的产生中发挥重要作用。Shinohara H等[20]发现依赖双链RNA的蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)在TNF-α刺激的破骨细胞分化过程中具有十分重要的地位，通过对RAW264.7细胞系的研究发现，经TNF-α处理后，破骨细胞内PKR升高，而PKR特异性抑制剂处理破骨前体细胞后，TNF-α所引起的促破骨细胞分化作用被减弱了，且这种作用是通过降低NFATc1而引起的。同时，TNF-α可以增加破骨前体细胞表面RANK的表达，同时激活基质细胞和骨基质脂肪细胞分泌RANKL[21]，而RANKL和RANK的相互作用促进了破骨细胞的分化过程[22, 23]，进一步说明TNF-α具有促进破骨细胞分化，进而加剧骨溶解的作用。在外界环境所导致的炎症刺激下，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，iNOS)和NO生成增加，在TNF-α刺激下，iNOS在mRNA水平和蛋白质水平均明显上升，同时，在细胞包浆内和培养基中均检测到NO升高，Lee SK等[24]发现iNOS特异性抑制剂可以抑制TNF-α对破骨细胞存活的促进作用，同时增加培养基内NO浓度可以缓解这种抑制作用，这表明TNF-α通过增加破骨细胞内iNOS的表达，增加NO的产生，进而促进破骨细胞的存活。TNF-α亦可以通过Erk1/2 p44 途径诱导破骨前体细胞表面Mac-1 分子的表达上调，并介导其向慢性炎症反应部位游走[25]，而Mac-1的CD11b亚基可以通过激活Syk通路促进破骨细胞的分化，由此说明TNF-α不仅发挥促破骨细胞形成的作用，同时可以上调CD11b分子，协同刺激破骨细胞成熟。本实验中，颗粒组小鼠血清TNF-α较其余三组升高，提示UHMWPE颗粒刺激机体产生了炎症反应，促进骨溶解的发生，而Syk抑制剂组及anti-CD11b单克隆抗体组小鼠血清TNF-α较颗粒组小鼠降低，说明anti-CD11b单克隆抗体可以通过下游Syk通路抑制TNF-α的产生，降低该细胞因子对破骨细胞分化及存活的促进作用，协同anti-CD11b抗体本身所发挥的阻碍破骨细胞分化效应，最终共同抑制了磨损颗粒诱导的骨溶解。

综上所述， anti-CD11b单克隆抗体通过封闭CD11b分子，干扰Syk通路的激活并降低TNF-α的产生，使破骨细胞分化受阻，最终抑制UHMWPE磨损颗粒诱导的骨溶解，提示CD11b分子或可作为关节置换术后无菌性松动的潜在治疗靶点。