姜黄素调控自噬在抑制HPV阳性宫颈癌细胞的体外研究

范世珍，于波海，陈旭娜，莫 莉

(深圳市福田区中医院，广东 深圳518034)

姜黄素调控自噬在抑制HPV阳性宫颈癌细胞的体外研究

范世珍，于波海，陈旭娜，莫 莉

(深圳市福田区中医院，广东 深圳518034)

目的 研究姜黄素在体外应用于诱导HPV阳性宫颈癌细胞凋亡与自噬的影响。方法 采用MTT检测法和流式细胞仪检测姜黄素(10,20,30,40 μmol/L)对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响；采用自噬抑制剂3-MA与姜黄素联用，观察自噬对姜黄素抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响；分光光度法检测SiHa细胞Caspase-3活性；应用ELISA检测姜黄素和(或)自噬抑制剂3-MA对宫颈癌SiHa细胞内Bcl-2、Bax和Beclin-1表达的影响。结果 姜黄素对HPV阳性的宫颈癌SiHa细胞的生长具有抑制作用，而且这种抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性；而姜黄素与3-MA联用后，对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞诱导凋亡的作用明显下降；与对照组相比，姜黄素组细胞Caspase-3活性明显提高(P<0.01)、Bax和Beclin-1的表达均明显升高(P<0.01)，而Bcl-2的表达明显降低(P<0.01)；与单独应用姜黄素组相比，姜黄素与3-MA联用组细胞Caspase-3活性和Bax表达均明显下降(P<0.01)，而Bcl-2的表达明显增加(P<0.01)。结论 姜黄素能有效抑制HPV阳性宫颈癌SiHa细胞的增殖，可以提高细胞Caspase-3活性、促进促凋亡因子Bax的表达升高和抑制凋亡因子Bcl-2表达下调，同时促进自噬相关蛋白Beclin 1的表达上调，从而诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞发生凋亡和自噬性细胞死亡。

姜黄素；宫颈癌SiHa细胞；细胞凋亡；自噬

(ChinJLabDiagn,2017,21:1264)

宫颈癌(Cervical cancer)作为全球第三大癌症类型，是导致癌症死亡率的第四大原因[1]，超过85%的宫颈癌病例和死亡发生在发展中国家。 其发病率与人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持续感染高度相关，特别是HPV 16和18型[2,3]。国外一项研究发现，有超过50%和13%的宫颈癌分别与HPV16和18相关[4]。姜黄素(Curcumin)是一种来自姜科姜黄属植物姜黄根茎中的多酚类物质[5,6]。现代分子生物学研究发现姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗病毒以及抗肿瘤等多种药理作用[7-13]。本研究旨在探索姜黄素对HPV 阳性宫颈癌SiHa细胞的增殖抑制作用，并初步研究这种作用是否与其对细胞自噬的调控有关，以期为临床上HPV阳性宫颈癌的治疗提供新的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂和仪器

姜黄素(纯度98%)、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。细胞培养胎牛血清(南京森贝伽生物科技有限公司)；AnnexinⅤ-FITC 凋亡试剂盒(碧云天)；Caspase-3分光光度法检测试剂盒(南京凯基公司)、Bcl-2和Bax ELISA试剂盒(上海酶联生物)；Beclin1检测试剂盒(上海艾睿生物科技有限公司)；酶标仪(美国 Bio-Rad 公司)；细胞恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)；流式细胞仪(FC500，美国Beckman)。其余试剂均购自上海生物工程有限公司。

1.2 细胞培养与处理

人宫颈癌细胞系SiHa购自中科院上海细胞库，用含10%热灭活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2以及95%空气的恒温细胞培养箱中培养。细胞传代10-20次后，实验设正常对照组(姜黄素 0 μmol/L)、姜黄素(10、20、30、40 μmol/L)组、3-MA(2 μmol/L)组和姜黄素(30 μmol/L)+3-MA组，分别加入姜黄素和(或)(2 μmol/L)3-MA作用24,48,72 h，随后收集细胞进行下一步研究。

1.3 MTT检测SiHa细胞增殖

选取对数生长期SiHa细胞接种于96孔板中，每孔接种量1.0×105个，经姜黄素和(或)3-MA作用24,48,72 h后，弃培养上清，加入100 μl MTT溶液(将10 μl 10 μg/ml MTT用90 μl培养基稀释)，继续培养4 h，待形成蓝紫色的结晶沉淀后倾去上清，加入100 μl DMSO溶液，振摇15 min，待甲瓒颗粒完全溶解，用酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定其吸光度。

1.4 SiHa细胞凋亡情况检测

取对数生长期SiHa细胞接种于96孔板中，每孔接种量1.0×105个，6 h后细胞稳定时进行实验，分别加入姜黄素和(或)3-MA处理细胞，48 h后按照 Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒说明书处理细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 分光光度法检测SiHa细胞Caspase-3活性

取对数生长期SiHa细胞接种于96孔板中，每孔接种量1.0×105个，6 h后细胞稳定时进行实验，分别加入姜黄素和(或)3-MA处理细胞，48 h后采用试剂盒所附操作指南通过酶标仪检测SiHa细胞内Caspase-3活性。

1.6 姜黄素对宫颈癌SiHa细胞内Bcl-2、Bax和Beclin-1表达的影响

取对数生长期SiHa细胞接种于96孔板中，每孔接种量1.0×105个，6 h后细胞稳定时进行实验，分别加入姜黄素和(或)3-MA处理细胞，48 h后分别按照试剂盒说明书对SiHa细胞内的Bcl-2、Bax和Beclin-1 进行检测。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 姜黄素对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

由图1可见，与对照组(0μmol/L)相比，不同浓度的姜黄素(10、20、30、40μmol/L)分别处理宫颈癌SiHa细胞24、48、72h后，宫颈癌SiHa细胞的生长均受到不同程度抑制，而且这种抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性。当30μmol/L浓度的姜黄素处理宫颈癌SiHa细胞48h后，宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制率为48.6%(P<0.01)，因此，后续实验中选用30μmol/L浓度的姜黄素进行。

图1 不同浓度姜黄素在不同时间点对宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制率

2.2 姜黄素与自噬抑制剂3-MA联用对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

由图2可见，与对照组相比，30μmol/L浓度的姜黄素作用于宫颈癌SiHa细胞48h后，宫颈癌SiHa细胞的生长均受到明显抑制(P<0.01)；而单独使用自噬抑制剂3-MA(2μmol/L)处理细胞48h，对宫颈癌SiHa细胞的生长无明显影响(P>0.05) 。与单独应用姜黄素组相比，姜黄素与3-MA联用组对宫颈癌SiHa细胞增殖的抑制作用明显下降(P<0.01)。MTT结果提示，姜黄素对宫颈癌SiHa细胞增殖具有明显抑制作用，而自噬抑制剂3-MA可以降低姜黄素抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的作用。

注：与对照组比较*P<0.01；与姜黄素组比较，#P<0.01。

2.3 姜黄素与自噬抑制剂3-MA联用对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

由图3细胞凋亡检测结果可见，与对照组相比，30μmol/L浓度的姜黄素组中细胞凋亡率明显增加(P<0.01)；而自噬抑制剂3-MA组中细胞的凋亡率无明显变化(P>0.05 ) 。与单独应用姜黄素组相比，姜黄素与3-MA联用组中宫颈癌SiHa细胞的凋亡率明显下降(P<0.01)。上述结果与MTT检测细胞活力结果相一致。

注：与对照组比较，*P<0.01；与姜黄素组比较，#P<0.01。

2.4 姜黄素对宫颈癌SiHa细胞Caspase-3活性的影响

如图4所示，与对照组相比，姜黄素处理可以提高宫颈癌SiHa细胞Caspase-3活性，并呈浓度依赖性(P<0.01)；而3-MA组细胞Caspase-3活性无明显变化(P>0.05 ) 。与单独应用姜黄素组相比，姜黄素与3-MA联用组中细胞Caspase-3活性明显下降(P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.01；与姜黄素组比较，#P<0.01。

2.5 姜黄素对宫颈癌SiHa细胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表达的影响

与对照组相比，姜黄素组细胞中Bax和Beclin-1表达明显增加(P<0.01)，而Bcl-2的表达明显减低(P<0.01)；而3-MA组细胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表达无明显变化(P>0.05 ) 。与单独应用姜黄素组相比，姜黄素与3-MA联用组细胞Bax表达均明显下降(P<0.01)，而Bcl-2的表达增加(P<0.01)，详见表1。

表1 姜黄素对宫颈癌SiHa细胞Bcl-2、Bax和Beclin-1表达的影响

注：与对照组比较，*P<0.01；与姜黄素30 μmol/L组比较，#P<0.01。

3 讨论

姜黄素是一种来源于姜黄根茎(姜黄)中的多酚类物质，也是亚洲和印度最喜欢的食品调味品之一[6]。以往的实验和临床研究发现，姜黄素具有多种生物和药理作用，包括抗炎[8，9]，抗氧化剂[10]，保肝[11]，抗关节炎[12]，抗癌和化学预防[13]和免疫调节[7]等。本实验研究应用姜黄素(10、20、30、40 μmol/L)分别处理宫颈癌SiHa细胞24、48、72 h后，发现姜黄素对HPV阳性的宫颈癌SiHa细胞的生长具有抑制作用，而且这种抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性。这与之前的文献报道相似[3,6,7]，然而姜黄素抑制HPV阳性宫颈癌SiHa细胞增殖的具体机制至今尚不完全清楚。

自噬是一种非凋亡性细胞死亡，通过溶酶体的作用降解不必要或功能失调的细胞成分，特别是当细胞面临诸如放射和化学治疗等恶劣环境时，自噬对细胞的生存必不可少。在自噬过程中，靶向的细胞质成分被装入双膜囊泡(自噬体)，其与溶酶体融合以产生自溶质并因此降解。研究发现自噬在调节细胞代谢平衡、抗肿瘤以及抵抗微生物等方面起着重要的生物学作用[14]。自噬是细胞防御和应激调控的重要机制。自噬在病毒感染和机体免疫中起调控作用，自噬过程异常可以导致细胞死亡。许多RNA病毒和DNA病毒感染的细胞都存在自噬现象。自噬在宿主免疫防御中起重要作用，包括细胞生长与死亡，肿瘤抑制和转移，抗原呈递，病原体清除，抗衰老和神经变性等[14,15]。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是目前常用的一种自噬抑制剂，主要通过抑制哺乳动物细胞中的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)来抑制自噬的起始阶段。本实验发现姜黄素可以诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞凋亡，而姜黄素分别与3-MA联用后，对HPV阳性宫颈癌SiHa细胞诱导凋亡的作用明显下降。说明姜黄素诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞凋亡的作用可能与诱导细胞自噬有关。

Beclin 1 是哺乳动物的自噬相关蛋白，与自噬的激活和自噬体的形成密切相关[16]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因， 而活化的Caspase 3 常被用作细胞凋亡的标记物，它们在肿瘤细胞凋亡中具有重要作用[17]。自噬与凋亡不单参与维持机体正常生理功能的平衡，还参与肿瘤的发生和发展过程，在特定条件下，凋亡与自噬之间存在着互相促进、互相拮抗又或是互相转换的复杂关系[18]。本实验发现姜黄素可以通过提高HPV阳性宫颈癌SiHa细胞Caspase-3活性，诱导细胞Bax的表达升高和Bcl-2的表达降低而发挥诱导细胞凋亡的作用。此外，我们还发现姜黄素在调控细胞中凋亡相关蛋白表达的同时，还引起细胞Beclin 1的表达升高；而与单独应用姜黄素组相比，姜黄素与3-MA联用后，宫颈癌SiHa细胞Beclin 1的表达均明显下降，同时联用3-MA组细胞Caspase-3活性和Bax的表达也明显下降，而Bcl-2的表达升高，姜黄素诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的作用受到明显抑制。提示姜黄素可以通过提高细胞Caspase-3活性、上调Bax表达和抑制Bcl- 2表达，同时上调自噬相关蛋白Beclin 1表达，诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞凋亡。

综上所述，本实验研究发现姜黄素能有效抑制HPV阳性宫颈癌SiHa细胞的增殖，可以提高细胞Caspase-3活性、促进促凋亡因子Bax的表达升高和抑制凋亡因子Bcl-2表达下调，同时促进自噬相关蛋白Beclin 1的表达上调，从而诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞发生凋亡和自噬性细胞死亡。在随后的实验中，我们将对姜黄素诱导HPV阳性宫颈癌SiHa细胞发生自噬的机制及其与凋亡的关系开展进一步研究，以进一步明确自噬在姜黄素抑制HPV阳性宫颈癌细胞增殖中的分子机制。

[1]McGraw SL,Ferrante JM.Update on prevention and screening of cervical cancer[J].World J Clin Oncol,2014,5(4):744.

[2]Munger K,Baldwin A,Edwards KM,et al.Mechanisms of human papillomavirus- induced oncogenesis[J].J Virol,2004,78(21):11451.

[3]曾 新,韩一栩,吴丽香.HPV在宫颈炎、宫颈癌前病变、宫颈癌中的检测意义分析[J].中国实验诊断学,2014,18(01):127.

[4]Lim CB,Ky N,Ng HM,et al.Curcuma wenyujin extract induces apoptosis and inhibits proliferation of human cervical cancer cells in vitro and in vivo[J].Integr Cancer Ther,2010,9(1):36.

[5]Singh AK,Misra K.Human papilloma virus 16 e6 protein as a target for curcuminoids,curcumin conjugates and congeners for chemoprevention of oral and cervical cancers[J].Interdiscip Sci,2013,5(2):112.

[6]Paulraj F,Abas F,Lajis NH,et al.The curcumin analogue 1,5-bis(2-hydroxyphenyl) 21,4-pentadiene-3-one induces apoptosis and downregulates E6 and E7 oncogene expression in HPV16 and HPV18-infected cervical cancer cells[J].Molecules,2015,20(7),11830.

[7]Sahebkar A,Cicero AF,Simental-Mendia LE,et al.Curcumin downregulates human tumor necrosis factoralpha levels:a systematic review and meta-analysis ofrandomized controlled trials[J].Pharmacol Res,2016,107,234.

[8]狄建彬,顾振纶,赵笑东,等.姜黄素的抗氧化和抗炎作用研究进展[J].中草药,2010,41(05):854.

[9]Panahi Y,Hosseini MS,Khalili N,et al.Antioxidant and anti-inflammatory effects of curcuminoid-piperine combination in subjects with metabolic syndrome:A randomized controlled trial and an updated meta-analysis[J].Clin Nutr,2015,34(6):1101.

[10]Panahi Y,Ghanei M,Hajhashemi A,et al.Effects of curcuminoids-piperine combination on systemic oxidative stress,clinical symptoms and quality of life in subjects with chronic pulmonary complications due to sulfur mustard:a randomized controlled trial[J].J Diet Suppl,2016,13(1):93.

[11]孙 永,彭明利.姜黄素及其衍生物在肝脏相关疾病中防治作用的研究进展[J].药学学报,2014,49(11):1483.

[12]Panahi Y,Rahimnia AR,Sharafi M,et al.Curcuminoid treatment for knee osteoarthritis:a randomized double-blind placebo-controlled trial[J].Phytother Res,2014,28(11):1625.

[13]Momtazi,A A,Shahabipour F,Khatibi S,et al.Curcumin as a MicroRNA regulator in cancer:a review[J].Rev Physiol Biochem Pharmacol,2016,171：1.

[14]Deretic V,Saitoh T,Akira S.Autophagy in infection,inflammation and immunity[J].Nat Rev Immunol,2013,13(10):722.

[15]Janku F,McConkey DJ,Hong DS,et al.Autophagy as a target for anticancer therapy[J].Nat Rev Clin Oncol.2011,8(9):528.

[16]Miracco C,Cevenini G,Franchi A,et al.Beclin 1 and LC3 autophagic gene expression in cutaneous melanocytic lesions[J].Hum Pathol 41(4):503,2010.

[17]高小胜,吕应年,吴科锋,等.半边旗提取物5F诱发结直肠癌细胞生长抑制及细胞凋亡[J].药学研究,2016,35(04):193，211.

[18]Stankov MV,El KM,Kumar TB,et al.Histone deacetylase inhibitors induce apoptosis in myeloid leukemia by suppressing autophagy[J].Leukemia,2014,28(3):577.

Curcumin regulated mitochondrial autophagy in the inhibition of HPV-positive cervical cancer cells

FANShi-zhen,YUBo-hai,CHENXu-na,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TraditionalChineseMedicalHospitalofFutian,Shengzhen,Guangdong518034,China)

Objective To study the effect of curcumin on the apoptosis and autophagy of HPV-positive cervical cancer cells in vitro.Methods The effects of curcumin (10,20,30,40 μmol / L) on the proliferation and apoptosis of HPV-positive cervical cancer SiHa cells were detected by MTT assay and flow cytometry; autophagy inhibitor 3-MA

was used in combination with curcumin to observe the effect of autophagy on curcumin inhibition of HPV positive cervical cancer cell proliferation and induction of apoptosis; the expression of Caspase-3 in SiHa cells was detected by spectrophotometry,and the effects of curcumin and / or autophagy inhibitors (3-MA) on the expression of Bcl-2 and Bax in cervical cancer SiHa cells were detected by ELISA.Results Curcumin inhibited the growth of HPV-positive cervical cancer SiHa cells,and the inhibitory effect was in a dose-dependent and time-dependent manner.After curcumin combined with 3-MA,the effect of curcumin on the HPV-positive cervical cancer SiHa The effect of cell apoptosis was significantly decreased.Compared with the control group,the expression of Caspase-3,Bax and Beclin-1 in the curcumin group was significantly higher than that in the control group (P<0.01),while the expression of Bcl-2 was significantly decreased (P<0.01) (P<0.01),and the expression of Bcl-2 was significantly higher in the combination of curcumin and 3-MA group (P<0.01),and the expression of Caspase-3,Bax and Beclin-1 increased (P<0.01).Conclusion Curcumin can effectively inhibit the proliferation of HPV-positive cervical cancer SiHa cells,can promote the expression of pro-apoptotic factors Bax,Caspase-3 and inhibit the down-regulation of apoptosis factor Bcl-2 expression,while promoting the expression of autophagy-related protein Beclin 1 Upregulation,which induced HPV-positive cervical cancer SiHa cells apoptosis and autophagic cell death.

Curcumin;Cervical cancer SiHa cells;Apoptosis;Autophagy

2015年深圳市科技研发资金基础研究资助项目 (JCYJ20150331091010278)

1007-4287(2017)07-1264-05

R737.33

A

范世珍，女，44岁，主任技师，学士学位，从事临床检验研究。

2016-12-26)