丹酚酸B通过抗氧化作用改善高脂饮食小鼠牙槽骨骨质疏松的实验研究

王丽丽 马如风 于娜 刘海霞 朱如愿 柳辰玥 张淑静 高誉珊 葛东宇 牛建昭高思华 张东伟*

1. 北京中医药大学基础医学院，北京 100029 2. 北京中医药大学中药学院，北京 100029 3. 北京中医药大学糖尿病研究中心，北京 100029

长期的高脂饮食可能导致骨吸收增加，骨形成减少[1]，最终诱发下颌骨骨量丢失，发生骨质疏松[2]。临床研究也发现肥胖患者的骨密度(bone mineral density，BMD)下降，骨脆性增加[3]。高脂饮食可以改变大鼠体内的氧化-还原平衡，引起丙二醛(malondialdehyde，MDA)和NF-κB水平升高，SOD活性降低[4]。高脂饮食也可以诱发Cathepsin的高表达[5]，从而促进骨质疏松的发生和发展[6]。研究发现，NADPH 氧化酶4(Nox4，NADPH oxidase 4)的高表达与NF-κB的激活、SOD水平降低[7]以及Cathepsin K的表达密切相关[8]。

研究表明，丹参对于骨骼疾病和肥胖症有一定的治疗作用，这种作用可能与其抑制Cathepsin K活性有关[9]。丹酚酸B(图1)是丹参的活性成分之一，具有抗氧化活性，可改善高脂饮食引起的糖脂类代谢紊乱和肝损伤[10]。但是，丹酚酸B是否通过抗氧化作用而改善骨质代谢，目前还未知。因此，为了探索丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨代谢作用和可能的作用机制，本研究拟采用丹酚酸B干预治疗高脂饮食的C57BL/6小鼠12 w后，观察小鼠牙槽骨组织病理变化和生物力学变化，以及其可能对氧化还原通路Nox4-SOD-NF-κB-Cathepsin K的调节作用。

图1 丹酚酸B的化学结构式Fig.1 Chemical structure of Sal-B

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要仪器：双能X线骨密度仪，美国Hologic公司；RM2255徕卡轮转式切片机，德国Leica公司；Olympus BX53倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯有限公司；WF-4005微机控制电子万能试验机，深圳市瑞格尔仪器有限公司。

1.1.2试剂和药材：ECL超敏发光液，购自北京普利莱基因技术有限公司；骨组织抗原修复液，购自上海舜百生物科技有限公司；Cathepsin K抗体(ab19027)和NF-κB-p65抗体(ab16502)，购自Abcam Biocompany(Cambridge,MA,美国)；Nox4多克隆抗体(NB110-58849)，购自Novus Biologicals (Littleton,CO,美国)；SOD多克隆抗体(sc-11407)，购自Santa Cruz Biotechnology (Dallas,TX,美国)；DAB 显色液，购自中山金桥生物科技公司(北京,中国)；高脂饲料(高脂饮食，MD12032)，包括45%脂肪、20%蛋白质和35%碳水化合物，购于江苏美迪森生物医药有限公司(扬州，江苏，中国)。

1.1.3动物：SPF级C57BL/6雄性小鼠，体重18～20 g，购自北京华阜康动物科技有限公司(北京，中国)，饲养于北京中医药大学科研实验中心清洁级动物实验室(合格证号SCXK(京)2011-0024，室温20℃，相对湿度±45%，光暗周期12 h/12 h)。实验期间，各组小鼠给予自由饮水。

1.2 方法

1.2.1动物模型构建：将30只C57BL/6小鼠适应性喂养1 w后，随机自由等分为正常组、模型组和丹酚酸B组等3组，每组10只。丹酚酸B组每天给予丹酚酸B[125 mg/(kg·d)]，正常组和模型组小鼠每天给予同体积的蒸馏水，连续灌胃12 w。实验期间，正常组小鼠给予正常饲料饲养，其余两组小鼠均给予高脂饲料饲养。

1.2.2取材及样品制备：12 w后，将小鼠用1%戊巴比妥(0.4 ml/100 g)腹腔麻醉，分离牙槽骨(mandibles)。 在冰上剥离小鼠附着的肌肉组织后，将其先置于10%中性福尔马林中固定72h后再放入15% EDTA钠(pH7.4)溶液脱钙，脱钙液每两周更换一次，连续脱钙3个月后冲水，包埋，切片备用。

1.2.3骨密度的测定：使用双能X线(DEXA)的小动物成像软件，对小鼠的牙槽骨进行扫描，然后统一划定形态结构相似的区域进行图像分析，测得牙槽骨BMD。

1.2.4牙槽骨HE染色：将牙槽骨石蜡切片(5 μm)常规HE染色，中性树胶封片，Olympus BX53倒置显微镜下观察病理变化并拍照。

1.2.5免疫组织化学染色：牙槽骨石蜡切片常规脱蜡至水，用骨组织抗原修复液抗原修复后，3% H2O2室温孵育30 min，然后用10%山羊血清封闭30 min，滴加1% BSA稀释的一抗[NF-κB (1∶50) or Nox4(1∶50) or Cathepsin K(1∶50) or SOD (1∶50)]，4 ℃孵育过夜，滴加辣根酶标记的二抗，室温孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。每组选取牙槽骨切片中6个互不重叠的视野，采用Image Pro Plus6.0分析软件进行图像分析，测定阳性细胞的平均吸光度(A)，取6个视野平均值纳入。A值高，则细胞阳性染色(胞浆内见棕黄色颗粒)强度高。

1.3 统计学分析

图4 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨组织中Nox4表达的影响。 A：免疫组化染色图片(×10，×40)。B：免疫组化图像分析结果。结果以表示，与模型组小鼠相比较，*P<0.05；与正常组小鼠相比较，#P<0.05Fig.4 The representative immunohistochemical staining pictures (A, ×10, ×40) and image analysis (B) show Nox 4 expression in the mandibles of mice. Values are expressed as means ± SD. *P<0.05 compared with HFD,#P<0.05 compared with normal

2 结果

2.1 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨骨密度的影响

骨密度是诊断骨质疏松的金指标，丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨骨密度的影响如图2所示。由图2可知，与正常组小鼠相比，模型组小鼠的牙槽骨骨密度明显降低(P<0.05)。丹酚酸B干预治疗12 w后，与模型组小鼠相比，丹酚酸B组小鼠骨密度明显升高(P<0.05)。结果表明丹酚酸B能够抑制高脂饮食引起的小鼠牙槽骨骨量丢失。

图2 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨骨密度改变的影响，结果以表示，*P<0.05，与模型组小鼠相比较；#P<0.05，与正常组小鼠相比较Fig.2 BMD change of mandibular bone (mg/cm2) after HFD. Values are expressed as means ± SD. *P< 0.05 compared with HFD, #P< 0.05 compared with normal

2.2 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨病理形态学的影响

实验小鼠牙槽骨组织切片HE染色结果如图3所示。光镜(×20)下观察发现，正常组小鼠牙槽骨镜下骨小梁排列整齐呈网状，骨微结构完整。与正常组小鼠相比，模型组小鼠牙槽骨骨小梁结构紊乱、变细、断裂。与模型组小鼠相比，丹酚酸B组小鼠的骨小梁排列相对整齐，骨微结构形态明显改善，骨小梁增粗排列较规则。这说明丹酚酸B能够通过改善高脂饮食引起的骨量丢失提高牙槽骨质量。

图3 小鼠牙槽骨HE染色(×20) Fig.3 The representative microscopic images show mandibular histological morphology stained by hematoxylin and eosin (HE×20)

2.3 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨中Nox4表达的影响

骨细胞中Nox4的高表达，可以激发氧化应激反应[11]。如图4所示，与正常组相比，模型组小鼠牙槽骨骨小梁表面，骨髓腔中可见Nox4表达增高(P<0.05)。与模型组相比，丹酚酸B组小鼠牙槽骨中Nox4 水平明显降低(P<0.05)。这说明丹酚酸B可调节高脂饮食引起的小鼠牙槽骨Nox4高表达而发挥抗氧化作用。

2.4 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨中SOD表达的影响

持续的氧化应激能够引起体内氧化还原失去平衡，导致SOD表达下降[12]。研究也发现SOD缺失的小鼠表现为骨脆性增加和骨密度下降[13]。如图5所示，与正常组小鼠相比，小鼠持续给予12w的高脂饮食后，牙槽骨SOD表达量明显减少(P<0.05)。与模型组小鼠相比，丹酚酸B能明显提高高脂饮食小鼠牙槽骨SOD水平(P<0.05)。这表明丹酚酸B可以通过调节SOD水平调节高脂饮食小鼠体内的氧化还原平衡。

图5 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨中SOD表达的影响。A：免疫组化染色图片(×10，×10)。B：免疫组化图像分析结果。结果以表示，与模型组小鼠相比较，*P<0.05；与正常组小鼠相比较，#P<0.05Fig.5 The representative pictures (A, ×10, ×10) and image analysis (B) of immunohistochemical staining show SOD expression in the mandible of mice. Values are expressed as means ± SD. *P< 0.05 compared with HFD, #P< 0.05 compared with normal

2.5 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨中NF-κB-p65表达的影响

氧化应激引起NF-κB活化，进而引起骨量丢失[14]。如图6所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠NF-κB-p65主要在牙槽骨骨膜和骨髓腔强阳性表达(P<0.05)。与模型组小鼠相比，丹酚酸B治疗12 w后，小鼠牙槽骨组织中的NF-κB-p65的表达明显降低(P<0.05)。这表明丹酚酸B能够通过降低高脂饮食引起的NF-κB-p65表达发挥抗氧化功能。

图6 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨组织中NF-κB-p65表达的影响。A：免疫组化染色图片(×10，×40)。B：免疫组化图像分析结果。结果以表示，与模型组小鼠相比较，*P<0.05；与正常组小鼠相比较，#P<0.05Fig.6 The representative pictures (A, ×10, ×40) and image analysis (B) of immunohistochemical staining show NF-κB-p65 expression in the mandibles of mice. Values are expressed as means ± SD. *P< 0.05 compared with HFD, #P< 0.05 compared with normal

2.6 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽骨中Cathepsin K表达的影响

Cathepsin K主要由破骨细胞表达分泌，被认为是破骨细胞活性和骨吸收的重要指标[15]。如图 7所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠 Cathepsin K 在牙槽骨骨膜骨吸收陷窝中表达增高(P<0.05)。丹酚酸B治疗12 w后，Cathepsin K表达明显下降且接近正常水平(P<0.05)。

图7 丹酚酸B对高脂饮食小鼠牙槽组织中Cathepsin K表达的影响。A：免疫组化染色图片(×10，×40)。B：免疫组化图像分析结果。结果以表示，与模型组小鼠相比较，*P<0.05；与正常组小鼠相比较，#P<0.05Fig.7 The representative pictures (A, ×10, ×40) and image analysis (B) of immunohistochemical staining show cathepsin K expression in mandibles of mice. Values are expressed as means ±SD. *P<0.05 compared with HFD, #P<0.05 compared with normal

3 结论

丹酚酸B作为丹参的活性成分之一，能促进松质骨形成，可用于治疗糖皮质激素引起的松质骨骨量丢失[9]。研究表明，丹酚酸B可有效抑制 HMSCs的分化、矿化[16]。同时，高脂饮食可引起颌骨骨密度降低，影响成骨细胞分化存活，最终导致颌骨骨质疏松[2]。本研究也发现小鼠高脂饮食12 w后，牙槽骨骨密度下降，骨微结构破坏。丹酚酸B干预12 w后，小鼠牙槽骨骨密度增加，骨小梁的病理状态明显改善。

高脂饮食可引起体内氧化还原失衡[17]。研究发现，高脂饮食引起Zucker大鼠Nox4 高表达，促进ROS 产生，进一步导致NF-κB-p65高表达[18]。丹酚酸B能下调人骨髓来源的上皮祖细胞Nox4水平[19]。丹酚酸B可抑制高脂饮食和/或链脲佐菌素引起的丙二醛升高和SOD下降[20]。本研究也发现丹酚酸B抑制Nox4和 NF-κB表达，促进 SOD表达，从而改善高脂饮食诱发的小鼠体内的氧化还原状态。

研究发现，高脂饮食诱发小鼠Cathepsin K高表达[21]，而抑制Cathepsin K活性有助于抑制骨质疏松的发生和发展[15]。NF-κB活化也可促使Cathepsin K 的高表达，而抑制NF-κB活化则有助于降低Cathepsin K的表达，阻碍骨质疏松的发生[22]。本研究发现，高脂饮食可以使小鼠牙槽骨组织的NF-κB 和Cathepsin K表达量上升，引起小鼠牙槽骨骨量丢失。而给予高脂饮食小鼠丹酚酸B干预12w后，牙槽骨中Cathepsin K 表达下降，骨密度升高，病理状态有一定程度的改善。

综上所述，高脂饮食小鼠表现出明显的牙槽骨骨微结构破坏，骨量丢失。丹酚酸B可通过调节Nox4/SOD/NF-κB/Cathepsin K信号通路而改善牙槽骨骨代谢。本研究也首次证明丹酚酸B具有抑制小鼠牙槽骨Cathepsin K表达的功能。