电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和缺血半暗区Tolls样受体4、核转录因子κB蛋白的影响①

叶涛，朱路文，唐强，李宏玉，梁碧莹，张继瑶，郑婷婷

·专题·

电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和缺血半暗区Tolls样受体4、核转录因子κB蛋白的影响①

叶涛1，朱路文2，唐强2，李宏玉1，梁碧莹1，张继瑶1，郑婷婷1

目的探讨电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的影响及其机制。方法雄性Sprague-Dawley大鼠36只随机分为假手术组(n=12)、模型组(n=12)和电针预处理组(n=12)。后两组线栓法制备大鼠脑缺血2 h再灌注模型。电针预处理组在缺血前给予电针百会干预2周。再灌注24 h后，采用改良神经功能缺损评分进行评定，HE染色观察缺血侧脑组织脑损伤程度，Western blotting检测脑缺血半暗区Tolls样受体4(TLR4)、核转录因子κB(NF-κB)蛋白表达。结果与模型组比较，电针预处理组神经功能缺损评分降低(P＜0.05)，脑组织损伤程度减轻，缺血半暗区TLR4、NF-κB蛋白表达下调(P＜0.05)。结论电针预处理通过下调缺血半暗区TLR4、NF-κB蛋白表达，诱导脑保护作用，降低炎性损伤程度，改善脑缺血再灌注损伤后大鼠的神经功能。

脑缺血再灌注损伤；电针；预处理；神经功能；Tolls样受体4；核转录因子κB；大鼠

[本文著录格式]叶涛，朱路文，唐强，等.电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和缺血半暗区Tolls样受体4、核转录因子κB蛋白的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(7)：745-749.

CITED AS：Ye T,Zhu LW,Tang Q,et al.Effects of electroacupuncture pretreatment on neurological function,and expression of Toll-like receptor 4 and nuclear factor κB in ischemic penumbra in rats after cerebral ischemia-reperfusion injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(7)：745-749.

脑卒中是全球人口死亡的第二大原因，也是致残的主要原因。85岁以上的老人约25%会发生脑卒中，其中约80%为缺血性脑卒中[1]。电针是针刺与电刺激的结合，通过促进血管生成、减轻炎症反应、调节血脑屏障、抑制凋亡等途径，降低脑卒中后脑损伤[2]；而在脑缺血前给予电针干预，即电针预处理，可诱导脑缺血耐受，对抗脑缺血再灌注损伤。研究显示[3-5]，Tolls样受体4/核转录因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB,TLR4/NF-κB)信号通路参与脑缺血再灌注损伤的炎症反应。

本研究观察电针预处理后，脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能和半暗区TLR4、NF-κB蛋白表达，拟从抗炎角度，探讨电针预处理的脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级成年雄性Sprague-Dawley大鼠36只，初始体质量220～240 g，鼠龄8～10周，均由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证书编号SCXK(辽)2015-0001。所有动物自由食水，室温23～25℃，湿度60%～70%，明暗各12 h交替，6：00～18：00为照明时间。实验过程中大鼠的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

计算机随机产生含36个数的随机数字表，将完成1～36编号的大鼠依次对应随机数字表中第1～36个数，用随机数字除以3，得余数0、1、2，对应分到假手术组、模型组和电针预处理组，每组12只。造模失败或死亡的大鼠从备用中大鼠补充。

1.2 主要设备和试剂

G6805-2A型低频脉冲电针仪：上海华谊公司。一次性无菌针灸针：北京汉医医疗器械中心。ELX-800型酶标仪：美国BIOTEK公司。Proline型微量移液器：苏州BIOHIT公司。TGL-16K台式高速冷冻离心机：湖南湘仪公司。RM2235型切片机：德国LEICA公司。WD-9405B型摇床、DYCZ-24DN型双垂直蛋白电泳仪、DYCZ-40D型转移槽：北京六一生物科技有限公司。

TLR4一抗、NF-κB一抗、内参β-actin一抗、羊抗兔IgG-HR、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL发光液：沈阳万类生物科技有限公司。预染蛋白分子量标准：加拿大FERMENTAS公司。PVDF膜：美国MILLIPORE公司。

1.3 模型建立

参考Longa[6]及前期研究[7]改良线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型。大鼠术前12 h禁食不禁水。2%戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔注射麻醉，术中大鼠保持自主呼吸。颈部备皮后颈正中偏右切口，弯钩镊钝性剥离，充分暴露颈总、颈外及颈内动脉。先结扎颈总以及颈外动脉，动脉夹阻断分叉处血流；7号针头在距分叉10 mm处刺一小口，松开动脉夹；将鱼线(直径0.26 mm)的一端用石蜡包裹，从此小口经颈总动脉插入颈内动脉，深约18～22 mm，阻断大脑中动脉血流供应。2 h后拔出栓线恢复灌注。再灌注后2 h，观察大鼠行为学改变，Longa评分2～3分的模型纳入实验。

1.4 电针预处理

安静的环境下将大鼠麻醉(方案与模型制备时相同)，恒温加热板维持体温。参照大鼠穴位图谱定位百会穴，即大鼠两耳尖连线中点，采用直径0.25 mm、长25 mm针灸针于百会向鼻尖方向平刺约5 mm。针柄连电针仪负极，正极接右耳根部，疏密波，频率2/15 Hz，强度为右耳出现轻微震颤。干预30 min后放回笼内，自然苏醒，自由进食、饮水。

1.5 干预方法

假手术组造模前2周接受麻醉操作，但不进行电针预处理干预；大鼠接受造模的各项手术操作，但不插入线栓。模型组造模前2周接受麻醉操作，但不进行电针预处理干预；大鼠接受模型制备。电针预处理组造模前2周每天行电针预处理干预，每周休息1 d，最后一次电针干预后48 h接受模型制备。

1.6 取材

再灌注24 h后，所有大鼠行改良神经功能缺损评分(modified Neurologic Severity Score,mNSS)[7-8]。各组取6只大鼠，2%戊巴比妥钠4～5 ml/kg腹腔注射麻醉。腹旁正中切口，显露腹主动脉并阻闭。沿膈边缘剪开，充分暴露心脏，缓慢灌注生理盐水150 ml，至大鼠前肢和心脏变白；改用4℃预冷的4%多聚甲醛灌注，待大鼠前肢抽搐，再缓慢滴注20 min，至大鼠成僵硬状态。迅速断头取脑，置4%多聚甲醛溶液中，4℃冰箱过夜；将脑组织从视交叉后1 mm向后切片，厚4 mm，脱水、透明、透蜡、包埋，制备厚5 μm石蜡薄片待HE染色。另取6只大鼠，麻醉后断头取脑，切取缺血半暗区组织液氮冻存，待Western blotting检测。

1.7 指标检测

1.7.1 mNSS

从行为、感觉、反射三个方面评估大鼠神经功能缺损程度。总分14分。1～4分为轻度缺损，5～9分为中度缺损，10～14分为重度缺损。

1.7.2 HE染色

石蜡切片60℃烘烤2 h，二甲苯脱蜡2次，每次15 min，梯度乙醇溶液水合，蒸馏水浸泡2 min，苏木素浸泡5 min，蒸馏水浸泡5 min，1%盐酸酒精分化3 s，自来水洗20 min，蒸馏水浸泡2 min，伊红染液浸泡3 min；梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，中性树胶封片[9]。光镜下观察拍照。

1.7.3 Western blotting

取样本，加入蛋白裂解液制成蛋白匀浆进行蛋白质抽提，4℃、12,000 r/min离心10 min，分离上清。采用BSA蛋白标准液并配以PBS缓冲液至酶标板，每孔20 μl，绘制标准曲线，计算样本蛋白浓度。本次实验上样体积20 μl，含蛋白40 μg。SDS-PAGE电泳分离目标蛋白，80 V恒压电泳2.5 h，转印到PVDF膜上，70 V转印1.5 h。室温下5%脱脂奶粉封闭，摇床缓慢摇动1 h，加入TRL4一抗(1∶1000)、NF-κB一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜。将PVDF膜浸入TTBS中，摇床10 min，洗膜重复3次；加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶5000)，37℃孵育45 min。TBST洗膜5次，每次10 min。加入ECL发光液，室温孵育5 min。转入暗盒，曝光显影。对胶片进行扫描，Quantity One图像分析软件定量分析。以假手术组某一样本蛋白表达量为1，其余样本均为与其较正后的相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计学分析。数据以(xˉ±s)表示。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 mNSS

假手术组mNSS评分为0；模型组mNSS评分较假手术组升高(P＜0.05)；电针预处理组mNSS评分较模型组降低(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠mNSS评分比较

2.2 HE染色

假手术组脑组织神经细胞形态正常，细胞排列整齐，密度大，胞核居中，核仁、核膜清晰可见，未见炎性细胞浸润现象。模型组脑组织缺血皮质区间质染色较浅、不均匀，水肿明显，细胞间结构松散，空泡样改变明显；皮质半暗区神经细胞密度降低，细胞排列较紊乱，可见细胞呈三角形皱缩、深染，细胞核固缩、边移，核仁、核膜消失，炎性细胞浸润明显，可见凋亡小体。电针预处理组病理改变减轻，细胞排列较整齐，细胞密度增加，间质水肿程度减轻，细胞皱缩畸形、胞核固缩深染、炎性细胞浸润等病理改变明显改善。见图1。

2.3 Western blotting

假手术组TLR4、NF-κB蛋白基础表达。与假手术组比较，模型组TLR4、NF-κB蛋白水平上调(P＜0.05)。与模型组比较，电针预处理组TLR4、NF-κB蛋白水平下调(P＜0.05)。见图2、表2。

图1 各组脑缺血再灌注后缺血侧神经病理(HE染色，bar=50 μm)

表2 各组脑组织缺血半暗区TLR4、NF-κB蛋白表达(相对表达量)

图2 Western blotting检测结果

3 讨论

“预处理”早在1986年就被Murry等[10]提出，他们发现在心肌梗死发生之前，多次发作心绞痛会延迟冠状动脉闭塞后细胞死亡，从而允许通过再灌注治疗更大程度地恢复心肌功能，即短暂发作的亚致死缺血损害可诱发强烈的内源性保护，降低随后的致命性缺血损害程度，进而提出“缺血耐受”现象。1990年，Kitagawa等[11]发现缺血耐受现象同样存在于脑组织，提出“脑缺血耐受”概念。此后，预处理的方式层出不穷，如缺氧预处理、低温预处理、药物预处理、针灸预处理、运动预处理、电针预处理等，均被证实可以诱导脑缺血耐受，诱导内源性保护机制，对抗随后由于脑缺血再灌注引发的各种继发性脑损伤，具有脑保护作用[12]。

电针是传统针刺与现代电疗法相结合的产物，作用效果比手针更持续稳定；结合脉冲电刺激，可以让患者持续感受到捻针效果，操作简易；电针的参数可调，能精确地将刺激强度保持在患者耐受范围内，更易被患者接受，在脑卒中临床治疗及康复中得以广泛应用。电针预处理即在脑缺血前给予重复或单次电针刺激，可以诱导脑缺血耐受，降低脑缺血再灌注引起的各种脑损伤[13]，其内源性保护机制涉及多水平、多通路、多靶点的调控[14-19]。

TLR所介导的炎性反应参与脑缺血再灌注损伤，其中TLR4的研究较多[20-24]。研究显示[25-26]，脑缺血2 h再灌注22 h后，与野生型小鼠相比，TLR4敲除小鼠脑梗死体积明显缩小，而TLR3、TLR9敲除小鼠却无此作用；应用TLR4抑制剂MTS510可显著抑制TLR4介导的促炎通路，具有明显的神经保护作用，提示TLR4是诱导脑缺血再灌注损伤的关键靶点。

TLR4可识别肉毒素、脂多糖，以及多种内源性分子，这些分子与TLR4结合后，逐步使NF-κB活化。NF-κB与免疫炎症反应有紧密联系。脑缺血再灌注损伤后，NF-κB会从细胞浆转移到细胞核，同时表达量明显增加[9]。NF-κB为炎症反应的初始因素，NF-κB可以与脑缺血后表达增多的多种黏附因子相结合，并使多种细胞因子上调；上调的细胞因子又反过来促进NF-κB活化，介导炎症级联反应加剧，加重炎性损伤程度[27]。

本研究显示，脑缺血再灌注24 h后，大鼠神经功能缺损严重，脑组织缺血皮质半暗区炎性损伤明显，同时TLR4、NF-κB蛋白表达上升，提示大鼠的神经功能缺损与TLR4/NF-κB信号通路介导的脑缺血再灌注炎性损伤过程有关；电针预处理干预后，TLR4、NF-κB蛋白表达显著降低，炎性损伤减轻，神经功能缺损得以改善，提示电针预处理可能是通过调控缺血半暗区TLR4、NF-κB蛋白表达，抑制TLR4/NF-κB介导的炎性级联反应，降低炎性损伤，从而改善神经功能。其具体的下游调控机制仍有待进一步阐明。

[1]Murray CJ,Lopez AD.Measuring the global burden of disease[J].N Engl J Med,2013,369(5)：448-457.

[2]Feng R,Zhang F.The neuroprotective effect of electro-acupuncture against ischemic stroke in animal model：a review[J]. Afr J Tradit ComplementAltern Med,2014,11(3)：25-29.

[3]Liao W,Tsai T,Ho T,et al.Neuroprotective effect of paeonol mediates anti-inflammation via suppressing Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 signaling pathways in cerebral ischemia-reperfusion injured rats[J].Evid Based Complement Alternat Med,2016,2016：3704647.

[4]Liu J,Chen Q,Jian Z,et al.Daphnetin protects against cerebral ischemia/reperfusion injury in mice via inhibition of TLR4/ NF-κB signaling pathway[J].Biomed Res Int,2016,2016：2816056.

[5]Wang Y,Chen G,Yu X,et al.Salvianolic acid B ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibiting TLR4/ MyD88 signaling pathway[J].Inflammation,2016,39(4)：1503-1513.

[6]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke,1989,20(20)：84-91.

[7]唐强,叶涛,朱路文,等.针康法对脑缺血大鼠神经功能和细胞外信号调节激酶1/2信号通路的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(1)：27-31.

[8]Li Y,Chopp M,Chen J,et al.Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopoietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(9)：1311-1319.

[9]Zhu L,Ye T,Tang Q,et al.Exercise preconditioning regulates the Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB signaling pathway and reduces cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury：a study in rats[J].J Stroke Cerebrovasc,2016,25(11)：2770-2779.

[10]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia：a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5)：1124-1136.

[11]Kitagawa K,Matsumoto M,Tagaya M,et al.'Ischemic tolerance'phenomenon found in the brain[J].Brain Res,1990,528 (1)：21-24.

[12]Stetler RA,Leak RK,Yu G,et al.Preconditioning provides neuroprotection in models of CNS disease：paradigms and clinical significance[J].Prog Neurobiol,2014,114(1)：58-83.

[13]叶涛,朱路文,唐强.电针预处理诱导脑缺血耐受的研究进展[J].针灸临床杂志,2015,31(2)：87-90.

[14]He X,Mo Y,Geng W,et al.Role of Wnt/β-catenin in the tolerance to focal cerebral ischemia induced by electroacupuncture pretreatment[J].Neurochem Int,2016,97：124-132.

[15]Jung YS,Lee SW,Park JH,et al.Electroacupuncture preconditioning reduces ROS generation with NOX4 down-regulation and ameliorates blood-brain barrier disruption after ischemic stroke[J].J Biomed Sci,2016,23(1)：1-11.

[16]Wu ZQ,Cui SY,Zhu L,et al.Study on the mechanism of mTOR-mediated autophagy during electroacupuncture pretreatment against cerebral ischemic injury[J].Evid Based ComplementAlternat Med,2016,2016：9121597.

[17]Ran QQ,Chen HL,Liu YL,et al.Electroacupuncture preconditioning attenuates ischemic brain injury by activation of the adenosine monophosphate-activated protein kinase signaling pathway[J].Neural Regen Res,2015,10(7)：1069-1075.

[18]林咸明,陈丽萍,姚旭.不同时程电针预处理对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子的影响[J].针刺研究,2015,40(1)：40-44.

[19]朱路文,叶涛,姜云飞,等.电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎性因子及细胞凋亡的影响[J].中国康复理论与实践,2016,22(7)：765-768.

[20]Zhao M,Zhou A,Xu L,et al.The role of TLR4-mediated PTEN/PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in neuroinflammation in hippocampal neurons[J].Neuroscience,2014,269 (Complete)：93-101.

[21]Raquel RD,Cristian GG,Carlos OS,et al.Calcineurin inhibitors cyclosporine A and tacrolimus induce vascular inflammation and endothelial activation through TLR4 signaling[J].Sci Rep,2016,6：27915.

[22]Li X,Yang J,Yang J,et al.RP105 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury via suppressing TLR4 signaling pathways in rat model[J].Exp Mol Pathol,2016,100(2)：281-286.

[23]Zhang J,Xia J,Zhang Y,et al.HMGB1-TLR4 signaling participates in renal ischemia reperfusion injury and could be attenuated by dexamethasone-mediated inhibition of the ERK/ NF-κB pathway[J].Am J Transl Res,2016,8(10)：4054-4067.

[24]Yang CJ,Yang J,Jian Y,et al.Radioprotective 105 kDa protein(RP105)：Is a critical therapeutic target for alleviating ischemia reperfusion induced myocardial damage via TLR4 signaling pathway[J].Int J Cardiol,2016,222：1069-1070.

[25]Hyakkoku K,Hamanaka J,Tsuruma K,et al.Toll-like receptor 4(TLR4),but not TLR3 or TLR9,knock-out mice have neuroprotective effects against focal cerebral ischemia[J].Neuroscience,2010,171(1)：258-267.

[26]Andresen L,Theodorou K,Grünewald S,et al.Evaluation of the therapeutic potential of anti-TLR4-antibody MTS510 in experimental stroke and significance of different routes of application[J].PLoS One,2016,11(2)：e0148428.

[27]于凌志,左艳丽,贾孟辉,等.核转录因子NF-κB对脑缺血再灌注干预机制的研究进展[J].中国民族医药杂志,2015,21 (7)：42-44.

Effects of Electroacupuncture Pretreatment on Neurological Function,and Expression of Toll-like Receptor 4 and Nuclear Factor κB in Ischemic Penumbra in Rats after Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

YE Tao1,ZHU Lu-wen2,TANG Qiang2,LI Hong-yu1,LIANG Bi-ying1,ZHANG Ji-yao1,ZHENG Ting-ting1
1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China;2.The Second Hospital Affiliated to Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China

ZHU Lu-wen.E-mail：zhuluwen1983@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture(EA)pretreatment on neurological function,and the expression of Toll-like receptor 4(TLR4)and nuclear factor κB(NF-κB)protein in ischemic penumbra after cerebral ischemia-reperfusion(CIR)injury. Methods A total of 36 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=12),model group(n=12)and EA group(n= 12).The later two groups were occluded their right middle cerebral arteries for two hours and reperfused.The EA group was pretreated with EA at Baihui(GV20)for two weeks before modeling.They were assessed with modified Neurological Severity Scores(mNSS),the injury in ischemic brain was detected with HE staining,and the expression of TLR4 and NF-κB protein in ischemic penumbra were detected with Western blotting,24 hours after reperfusion.Results The score of mNSS decreased(P＜0.05),the injury of brain tissue ameliorated,and the expression of TLR4 and NF-κB decreased in ischemic penumbra(P＜0.05)in EA group compared with those in the model group.Conclusion EA pretreatment can reduce the injury and improve the neurological function in rats after CIR by down-regulating the expression of TLR4 and NF-κB protein in ischemic penumbra.

cerebral ischemia-reperfusion injury;electroacupuncture;pretreatment;neurological function;Toll-like receptor 4;nuclear factor κB;rats

R743.3

A

1006-9771(2017)07-0745-05

2017-03-29

2017-05-02)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.07.001

1.国家自然科学基金项目(No.81503666)；2.黑龙江省自然科学基金项目(No.QC2015103)；3.哈尔滨市科技创新人才研究专项基金项目(青年后备人)(No.2014RFQGJ150)；4.黑龙江中医药大学领军人才计划项目(No.2012RCL02)；5.黑龙江中医药大学研究生创新科研项目(No. yjscx2016037)。

1.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市150001。作者简介：叶涛(1989-)，男，汉族，福建漳平市人，博士研究生，主要研究方向：脑卒中中医康复基础与临床研究。通讯作者：朱路文(1983-)，男，副教授，主要研究方向：神经系统疾病中医康复基础与临床研究。E-mail：zhuluwen1983@126.com。