皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum产油脂发酵培养基优化

汪洲，肖玲玲，龚大春

（1.三峡大学生物催化重点实验室，湖北宜昌443002；2.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌443002）

皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum产油脂发酵培养基优化

汪洲1，肖玲玲2，*龚大春1

（1.三峡大学生物催化重点实验室，湖北宜昌443002；2.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌443002）

对皮状丝孢酵母发酵产油脂培养基中的碳氮源种类及添加量、KH2PO4添加量、接种量等影响因素进行优化。试验表明，葡萄糖为最佳碳源，蛋白胨为最佳氮源，在葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，KH2PO4质量浓度1.0 g/L，最佳接种量15%时，油脂得率可达到细胞干质量的62%，比优化前提高了50%。

皮状丝孢酵母；油脂；培养基；优化

生物柴油是以生物质资源为原料加工而成的一种液态燃料[1]，是最重要的清洁燃料之一，也是最有发展前景的柴油替代燃料。生物柴油一般由各种动、植物油脂经酯化工艺而得，而微生物油脂的脂肪酸组成与植物油相近，以C16和C18系脂肪酸为主，利用微生物发酵生产油脂具有原料丰富、价格便宜、生长周期短等优点，且不受场地、季节、气候的影响，一年四季均可发酵生产[2-4]。

研究发现，不同种属的微生物具有不同含油量、油脂组成及相对脂肪酸的含量，而皮状丝孢酵母具有较高的产油能力。就同一种微生物菌株而言，如果培养条件不同，那么其产油量、油脂脂肪酸组成成分及各种脂肪酸的相对含量也不一定相同，任何培养条件的变化都会对最终的产脂量造成直接或间接的影响[5-7]。因此，试验对皮状丝孢酵母发酵产油脂培养基进行优化，为生物油脂的中试放大研究提供一定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum），艾伦·麦克德尔米德再生能源研究所提供。

1.1.2 培养基

豆芽汁固体斜面培养基：豆芽100 g/L，白砂糖50 g/L，琼脂20 g/L，水1 000 mL，pH值自然。于121℃下灭菌20 min，备用。

种子液培养基：PDA培养基。

基础发酵培养基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L。

1.1.3 种子液的制备

选取保存于斜面的酵母细胞，于豆芽汁固体斜面培养基上30℃活化培养72 h，用接种环挑取2环活化后的酵母细胞接入到50 mL的种子液培养基中，于30℃，180 r/min条件下振荡培养24 h。

1.1.4 发酵产油脂的培养

以10%接种量接种于50 mL发酵培养基中，于22℃，转速140 r/min，pH值8条件下振荡培养36 h。每组做5个平行试验。

1.2 分析方法

1.2.1 菌体浓度的测量

试验采用池度法对菌体浓度进行间接测量。取一定量的培养液，用新鲜培养基稀释到合适浓度后在紫外分光光度计于波长600 nm处测量吸光度（OD）；以新鲜的培养基做空白对照。每个样品重复测定3次，取其平均值。

1.2.2 菌体干质量的测量

试验采用称质量法测定菌体干质量，取出一定体积的发酵液（通常为5 mL）至已烘干称质量的10 mL离心管中，以转速10 000 r/min离心5 min，弃上清液，用去离子水洗涤3次，离心去上清液后置于105℃烘箱烘至恒质量，称质量。菌体干质量的计算公式如下：

式中：总质量——样品烘干后的质量，g；管质量——空管子烘干后的质量，g；

V液——用来测干质量发酵液的体积，L。

1.2.3 油脂含量的测量

试验采用酸热——有机溶剂萃取法，对油脂进行提取。量取一定体积的发酵液，以转速10 000 r/min离心5 min去上清液，用去离子水洗涤菌体2遍，离心弃上清液。向盛有菌体的离心管中加入适量4 mol/L的HCl溶液浸泡30 min，沸水浴10 min，置于冰上迅速冷却15 min，再加入3～4倍体积的甲醇-氯仿溶剂（甲醇∶氯仿=1∶2，V/V），混匀后，以转速180 r/min振荡1 h，10 000 r/min离心5 min，使有机相和水相迅速分离，用玻璃针管吸取下层有机相至预先烘干称质量的50 mL圆口烧瓶中，80℃旋转蒸发掉有机溶剂，置于烘箱至恒质量，用分析天平称量得到油脂质量。

2 结果分析

2.1 不同碳源对皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂的影响

碳源是发酵培养基的主要成分之一，可以作为微生物细胞结构或代谢产物中碳价来源的营养物质。为了能利用秸秆糖化液，试验采用葡萄糖与木糖以不同的比例添加到培养基后，进行皮状丝孢酵母发酵产油脂的研究。

不同碳源对皮状丝孢酵母产油脂的影响见表1。

表1 不同碳源对皮状丝孢酵母产油脂的影响

由表1可知，当葡萄糖与木糖的质量浓度比例越大，菌体干质量越大，油脂得率也越高，说明葡萄糖更适宜菌体的生长和油脂的合成，同时结果也表明木糖也能为皮状丝孢酵母所利用。因此，试验选择更能促进菌体生长和油脂合成增加的葡萄糖作为碳源。

2.2 不同氮源对皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂的影响

氮源作为培养基中必不可少的部分，一般只提供合成细胞质和细胞中其他结构的原料，不作为能源。氮源又分有机氮源和无机氮源，其中蛋白胨为有机氮源，硫酸铵为无机氮源，又为速效性氮源。不同氮源对皮状丝孢酵母产油脂的影响见表2。

表2 不同氮源对皮状丝孢酵母产油脂的影响

由表2可知，蛋白胨与硫酸铵以不同比例添加到培养基后，观察皮状丝孢酵母发酵产油脂的情况，结果显示有机氮源明显更促进菌体密度的增大和油脂含量的增大，这是由于有机氮源中含有丰富的蛋白质和氨基酸类物质，能有效地促进菌体生长和产物合成；而无机氮源虽能供菌体生长，却不利于代谢产物的合成。其中，以蛋白胨为氮源时，油脂得率和菌体干质量在发酵结束时最大。因此，试验选择更能促进菌体生长和油脂合成增加的蛋白胨作为氮源。

2.3 不同碳氮源添加量对皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂的影响

不同碳氮源添加量对皮状丝孢酵母产油脂的影响见表3。

由表3可知，随着碳氮源添加量的增大，菌体干质量减小，但油脂得率随之增大，说明在适宜的碳氮添加量范围内有利于油脂的合成增加；随着葡萄糖和蛋白胨质量浓度的升高，菌体干质量会随之增大。葡萄糖质量浓度为20～40 g/L时，油脂得率会随着升高；但质量浓度继续升高，油脂得率会随着降低。说明碳氮源的质量浓度过高，仍能有利于皮状丝孢酵母的大量繁殖，但同时会增大发酵液黏度，从而影响溶解氧体积分数，引起菌体的代谢异常，最后影响油脂的合成。结果表明，葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L为最佳碳氮源组合，油脂得率最高可达59.77%。

2.4 不同KH2PO4质量浓度对皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂的影响

KH2PO4是微生物生长和代谢所需的磷酸盐和钾盐的重要来源，磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。腺二磷（ADP）、腺三磷（ATP）是重要的能量传递者，参与一系列的代谢反应。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。微生物对磷的需要量一般为0.005～0.010 mol/L。钾不参与细胞结构物质的组成，它是许多酶的激活剂。将KH2PO4以不同质量浓度添加到培养基后，研究皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂的情况。

不同KH2PO4质量浓度对皮状丝孢酵母产油脂的影响见表4。

表3 不同碳氮源添加量对皮状丝孢酵母产油脂的影响

表4 不同KH2PO4质量浓度对皮状丝孢酵母产油脂的影响

由表4可知，当KH2PO4质量浓度从0增加至1.0 g/L时，菌体干质量和油脂含量会随着KH2PO4质量浓度的增加而增大，说明适宜的KH2PO4质量浓度会促进皮状丝孢酵母的生长和产物的合成；但随着KH2PO4质量浓度继续增大，菌体干质量和油脂得率反而降低，说明过量的KH2PO4会抑制菌体的生长和产物的合成，并且浪费资源。因此，确定KH2PO4质量浓度1.0 g/L时为最佳。

2.5 接种量对皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂的影响

接种量决定了生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。通常接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还引起其他不正常情况；接种量过高，会使菌体生长过快，培养液黏度过高，造成供氧不足，影响发酵水平。

接种量对皮状丝孢酵母产油脂的影响见表5。

表5 接种量对皮状丝孢酵母产油脂的影响

由表5可知，接种量在5%～15%时，随着接种量的增加，菌体干质量增大，油脂得率也增大；接种量过大，会增加生产成本，20%的接种量对产油脂贡献增加不大。因此，确定接种量为15%。

2.6 优化条件下产油脂试验

通过以上培养基条件优化，在葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，KH2PO4质量浓度1.0 g/L，接种量15%时，油脂得率可达到细胞干质量的62%。

3 结论

通过对皮状丝孢酵母摇瓶发酵产油脂条件中的不同碳氮源种类及添加量、KH2PO4质量浓度、接种量进行优化，结果表明葡萄糖为最佳碳源，蛋白胨为最佳氮源，且在葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，KH2PO4质量浓度1.0 g/L，接种量15%时，油脂得率可达到细胞干质量的62%，比优化前提高了50%。

[1]邱松山，王彦安，林梦红.发酵荔枝渣制备微生物油脂[J].食品与发酵工业，2015，41（8）：116-120.

[2]陈士华，孙强，孙莉云.一株高产油脂微生物菌种的筛选与鉴定[J].河南工业大学学报（自然科学版），2013，34（6）：65-68.

[3]袁锦云，艾佐佐，张志斌.皮状丝孢酵母B3利用木薯淀粉发酵生产微生物油脂[J]．生物工程学报，2011，27（3）：453-460.

[4]崔丁维，胡学超，包珊珊，等.酶法破碎微生物细胞的研究进展[J].微生物学通报，2010，37（11）：1 672-1 678.

[5]Gao Z，Ma Y Q，Wang Q H，et al.Effect of crude glycerol impurities on lipid preparation by Rhodosporidium toruloides yeast 32489[J].Bioresource Technology，2016（8）：373-379.

[6]孔凡敏，赵祥颖，田延军，等.酸热法提取酵母油脂条件的研究[J].中国酿造，2010（5）：143-146.

[7]王敏，李市场，刘红霞，等.粘红酵母Rhodotorula glulinis微生物油脂提取工艺研究[J].中国粮油学报，2010，25（6）：71-75.◇

Optimization of Fermentation Medium for Lipid Production from Trichosporon cutaneum

WANG Zhou1，XIAO Lingling2，*Gong Dachun1
（1.Key Lab of Biocatalysis，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002，China；2.Hubei Three Gorges Polytechnic，Yichang，Hubei 443002，China）

The effective factors of carbon and nitrogen source，carbon and nitrogen amount，KH2PO4amount，different inoculation volume on lipid production from Trichosporon cutaneum are optimized.The results show that the glucose is the best carbon source，peptone is the best nitrogen source.The lipid yield can be up to 62%under the conditions of glucose 40 g/L，peptone 1.33 g/L，KH2PO41.0 g/L，the inoculation volume 15%with increasing 50%than before.

Trichosporon cutaneum；lipid；medium；optimization

Q93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.003

1671-9646（2017）06a-0009-03

2017-05-07

宜昌市科技攻关项目“纤维素糖化制备微生物柴油的工艺研究”（A15-301-B04）。

汪洲（1989—），男，在读硕士，研究方向为微生物发酵。

*通讯作者：龚大春（1967—），男，博士，教授，硕士生导师，研究方向为微生物育种、发酵及新型酶制剂。