MiR-196a与ZG16蛋白在结直肠癌中的表达意义及相关性分析

樊鑫鑫 赵青芳 关露露 刘奇 王茂勋 吕慧芳 陈小兵

MiR-196a与ZG16蛋白在结直肠癌中的表达意义及相关性分析

樊鑫鑫 赵青芳 关露露 刘奇 王茂勋 吕慧芳 陈小兵

目的 通过测定结直肠癌患者癌组织、癌旁正常组织中miR-196a和ZG16 mRNA的相对表达水平，探讨二者与患者临床病理特征的关系及二者相关性。方法 应用实时荧光定量PCR，检测83例结直肠癌患者癌组织、癌旁正常组织中miR-196a和ZG16 mRNA的相对表达水平，并分析二者相关性及其与患者临床病理特征之间的关系。结果 癌组织中ZG16 mRNA表达量明显低于正常组织（t=-27.511，P＜0.001）；癌组织miR-196a表达量明显高于正常组织（t=9.04，P＜0.001），且二者在癌组织中的表达量呈显著负相关（P＜0.001，r=-0.469）；癌组织中miR-196a、ZG16mRNA的表达情况与肿瘤部位、有无淋巴结转移、有无远处转移、肿瘤分期明显相关（P＜0.05），与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、CEA水平无关（P＞0.05）。结论 两者可能推动结直肠癌的发生、发展，可能是潜在的病情评估及疗效评价的生物标志物；两者在左右半结直肠癌中表达量分别有差异，临床上可能有助于左右半结直肠癌靶向药物疗效预测及新的治疗靶点的发现。

结直肠肿瘤； miR-196a； ZG16蛋白； 临床病理

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在世界范围内的癌症相关死亡率中位居前列。早期诊断在降低其死亡率中扮演着重要角色，生物标志物的研究对于结直肠癌的早期诊断、个体化治疗、发现复发转移等具有重要意义。

前期预实验提示miR-196a和酶原颗粒蛋白16（zymogen granule protein 16，ZG16蛋白）在结直肠癌组织中的表达量与癌旁正常组织中的表达量差异显著［1］，本研究将扩大样本量对预实验结论进行进一步的验证，并探讨二者与患者临床病理特征的关系及两项指标在癌组织中表达的相关性。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年7月至2016年12月在郑州大学附属肿瘤医院限期行结直肠癌手术治疗的患者的癌组织及癌旁5 cm以上的正常组织标本，共计83例，术前所有患者均未接受放疗和化疗；组织学分级采用世界卫生组织病理分级标准，术后分期采用国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）制定的第7版结直肠癌分期标准；83例患者，平均年龄：（53.45±10.17）岁，一般临床资料和临床病理特征详见表1。本项目受河南省杰出青年基金“MicroRNAs预测结直肠癌个体化治疗指纹图谱建立”项目资助，并通过郑州大学附属肿瘤医院医学研究伦理委员会的批准和许可。

二、主要试剂和仪器

实验应用的主要试剂包括Triozol RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、QR-PCR试剂盒等，主要仪器包括全波长扫描多功能读数仪、7500 Fast Dx Real-Time PCR 仪、电泳仪等。具体试剂及生产厂家见表2

三、实验步骤

（一）组织总RNA提取

标本离体30分钟内分别取出3组癌组织及正常组织放入冻存管后迅速放入液氮中保存，按照美国 Thermo Fisher Scientif i c公司提供的Triozol RNA提取试剂盒的使用说明进行提取57对大肠癌组织及其配对癌旁组织的RNA，并对RNA质量检测：通过凝胶电泳检测提取总RNA完整性，并应用全波长扫描多功能读数仪对提取的总RNA的浓度和纯度进行鉴定。

表1 83例患者的临床病理资料

表2 主要实验试剂和仪器

（二）Real Time PCR

应用SYBR ® Green 方法反转录出cDNA，后选择SYBR ® Premix Ex Taq TM II 进行ZG16 mRNA和miR-196a的Real Time PCR反应，冰上配制PCR反应液，两步法PCR扩增反应条件为：预变性：95 ℃，30 s（1 cycle），PCR反应：95 ℃，5 s＋60 ℃，30 s（40 cycle），循环结束后，设置温度从60 ℃升高到95 ℃获取熔解曲线。

四、数据分析

分别记录内参基因和待测基因的Ct值。根据荧光定量PCR相对定量统计方法［2］：2-△△Ct表示待测基因相对正常组织的表达量；△△Ct=（Ctl-Ct2）癌组织-（Ctl-Ct2）癌旁正常组织；2-△Ct表示待测基因相对内参的表达量，△Ct=（Ctl-Ct2）癌组织/癌旁正常组织；其中：Ctl为待测基因miR-196a/ ZG16mRNA的临界循环数；Ct2：为内参基因U6/ HPRT1的临界循环数。

五、统计学分析

采用 SPSS 21.0软件、Graphpad prism 7.0软件分析实验结果，组间比较采用 t检验，癌组织中miR-196a与ZG16mRNA相对表达量有无相关性采用Person相关性分析，其中P值为双向性检验，检验水准为 α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 T1～3分别为肿瘤组织，N1～3分别为肿瘤组织对应的癌旁正常组织

结 果

一、检测提取组织中total RNA 的纯度、浓度、完整性

将提取的 83对结直肠癌癌组织及配对癌旁正常组织中的total RNA，采用 1%琼脂糖凝胶电泳法检测所提取total RNA 的完整性。RNA完好提出时，肉眼可观察到三条条带，从上到下依次为 28 s、18 s、5 s，其中 28 s 最亮，并且其亮度约是 18 s 条带亮度的2倍，5 s条带较模糊，部分甚至不显示。该电泳结果说明所提取组织中的 total RNA完整性好，如图1。同时应用全波长扫描式多功能读数仪测定A260/A280，值均在1.8～2.0，提示提取total RNA纯度、浓度较好（图1）。

二、57例结直肠癌患者癌组织中miR-196a及ZG16相对表达量

57例结直肠癌患者癌组织中miR-196a相对表达水平最高为2.54，最低为0.51，其中74/83（89.16%）患者癌组织中相对表达量高于癌旁正常组织，经t检验分析癌组织中miR-196a平均表达水平高于正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.001）；癌组织中ZG16 mRNA相对表达水平最高为1.24，最低为0.21，其中83/83（100%）患者癌组织中相对表达量低于癌旁正常组织，经t检验分析癌组织中ZG16 mRNA平均表达水平低于正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.001）。见图2，表3。

三、ZG16mRNA与miR-196a相关性检测

二者在癌组织中的表达在0.01水平（双侧）上显著相关（P＜0.001）；其中r=-0.469，详细见表4，图3。

四、结直肠癌组织中microRNA-196a和ZG16mRNA的相对表达量与患者临床病理特征之间的关系

miR-196a与ZG16mRNA在结直肠癌癌组织中的表达情况与肿瘤部位、有无淋巴结转移、有无远处转移、肿瘤分期具有明显相关性，与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、CEA水平无关（P＞0.05）。详细见表5。

讨 论

结直肠癌是我国乃至全世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国其发病率以每年4.2%的速度递增。虽然学术界在近些年来在结直肠癌的诊治方面取得了一定的进展，但患者的长期生存率并没有明显改善，早期诊断和治疗在降低结直肠癌病死率中扮演着重要角色。因此，发现和应用新的有效的生物标志物以提高其早期诊出率、探索有效的个体化治疗方案、动态评估病情、及时发现复发转移、改善其预后成为目前研究的热点。

图2 癌组织、癌旁正常组织中miR-196a和ZG16mRNA的相对表达量

表3 microRNA-196a 和ZG16mRNA在癌组织和癌旁正常组织中的表达

表4 ZG16 mRNA与miR-196a 在癌组织中相对表达量相关性分析

图3 ZG16 mRNA与miR-196a 在癌组织中表达散点图

ZG16蛋白是1994年Cronshagen U等［3］在筛选大鼠胰腺cDNA表达库时发现的一个分子量为16 kDa的可溶性蛋白，主要由肝脏、胰腺、腮腺、消化道分泌，截至目前为止，对其研究大多局限于肝脏和胰腺，对其在结直肠中表达的研究较少［4-5］。Chen等［1］通对TCGA数据库收集的数据行RNA测序，结果发现结直肠癌组织中的ZG16蛋白表达量明显低于癌旁正常组织；Kim M等［6］研究证实，正常结直肠组织中可检测到可溶性蛋白ZG16的表达，在炎性病变（溃疡性结肠炎）中可检测到其高表达，在结肠癌组织中低表达；Wang等［7］发现在人类正常结肠组织中可检测到ZG16蛋白的表达，而在结肠肿瘤组织中却检测到ZG16 蛋白表达下调甚至缺失；Chen等［1］经Target Scan数据库预测寻找与ZG16蛋白有关的miRNAs，结果发现ZG16基因3’UTR端有7个碱基可与miR-196a 5’端构成共价键，推测ZG16基因表达可能受上游miR-196a的调控。

MiR-196a是miRNAs重要成员之一，MiRNA是一类长度约为18～22个核苷酸的小内源性非编码RNA，主要是通过调控靶基因的转录和翻译，发挥在靶基因的转录后水平调控其表达的作用，其作用类似癌基因或抑癌基因［8-9］。作为miRNAs的重要成员，miR-196a主要是通过调控下游靶基因的表达量而发挥功能的，如下调KRT5、SPRR2C和S100A9等基因的表达量促进食管癌的发生、发展［10］；通过下调HOXA5促进非小细胞肺癌细胞的增殖、扩散和转移［11］；下调靶基因p27kip1的表达，促进胃癌的发生，且其高表达能够促进胃癌的治疗耐药，在乳腺癌中也发现类似结果［12-13］；研究发现，其在妇科肿瘤、头颈部肿瘤等肿瘤中同样具有致癌作用［14-17］。

表5 miR-196a、ZG16mRNA与CRC患者临床病理特征的关系

本研究中我们采用 qRT-PCR 检测了结直肠癌患者癌组织及配对癌旁正常组织中miR-196a和ZG16 mRNA的表达水平。结果发现，与配对的正常组织相比，ZG16 mRNA在癌组织中的表达降低，miR-196a在癌组织中的表达升高，可能促进肿瘤的增殖、扩散，但具体作用机制不明；ZG16 mRNA的表达与miR-196a的表达显著相关，两者之间可能存在调控关系；结直肠癌癌组织中miR-196a与ZG16mRNA的表达量与有无淋巴结转移、有无远处转移及肿瘤分期有关，与性别、年龄、肿瘤大小、CEA水平、分化程度、浸润深度无关；由此可见，两项指标均与有无淋巴结转移、有无远处转移及分期有关，提示两者可能能够推动结直肠癌大发生、发展，可能是潜在的评估病情及疗效评价、预后预测的生物标志物。

此外，由于结直肠癌有多个发病部位，原发肿瘤部位在转移性结直肠癌治疗决策中的作用，成为近两年结直肠癌领域的热点话题。目前的研究结论显示［14-20］，左半结肠癌与APC、P53、SMAD4等抑癌基因的失活及KRAS基因突变等相关；而右半结肠癌则与癌基因的激活、BRAF基因突变、MLH1基因的甲基化失活和MSI阳性表达等相关。近年来越来越多的研究显示，转移性结直肠癌的靶向治疗疗效可能受肿瘤部位和目前已知的这些分子事件共同影响，是否还存在其他分子参与仍有待研究。在本研究中，我们对ZG16 mRNA和miR-196在左右半结直肠癌中的表达差异也进行了探索，结果发现，两者在左右半大肠癌中表达量均有差异，可能与不同部位大肠癌致病机制不同有关，进一步分析也许会有助于了解左右半的生物学特征差异，来更好解释在左右半转移性结直肠癌患者中的治疗疗效及预后等方面差异。

同时本研究也存在一些问题：（1）ZG16蛋白表达测定与ZG16 mRNA测定不完全一致，不能完全根据mRNA表达量等同于蛋白表达量，可加做Weston Blot测蛋白表达量或者免疫组化测阳性率，对本研究结论进行验证；（2）病例数较少，且仅有组织学标本相应指标的测定，未进行体外细胞实验验证；（3）未将两指标微卫星不稳定性等可能影响结直肠癌预后的因素进行分析，若均纳入讨论，可能影响本研究的结论。总之，本研究发现miR-196a和ZG16mRNA可能是结直肠癌潜在的生物标志物物，且两者在癌组织中的表达量呈显著相关，二者之间可能存在调控关系；由于两者在左右半大肠癌组织中表达不同，不仅进一步论证了左右半结直肠癌可能存在不同的发病机制，且可能有助于左右半结直肠癌靶向药物疗效预测和发现新的治疗靶点。

[ 1 ] Chen X, Du P, She J, et al. Loss of ZG16 is regulated by miR-196a and contributes to stemness and progression of colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(52): 86695-86703.

[ 2 ] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) Method [J]. Methods, 2001, 25(4):402-408.

[ 3 ] Cronshagen U, Voland P, Kern HF. cDNA cloning and characterization of a novel 16 kDa protein located in zymogen granules of rat pancreas and goblet cells of the gut [J]. European Journal of Cell Biology, 1994, 65(2): 366-377.

[ 4 ] Kleene R, Dartsch H, Kern HF. The secretory lectin ZG16p mediates sorting of enzyme proteins to the zymogen granule membrane in pancreatic acinar cells [J]. European Journal of Cell Biology, 1999, 78(2): 79-90.

[ 5 ] Schmidt K, Schrader M, Kern HF, et al. Regulated apical secretion of zymogens in rat pancreas. Involvement of the glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoprotein GP-2, the lectin ZG16p, and cholesterol-glycosphingolipid-enriched microdomains [J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(17): 14315-14323.

[ 6 ] Kim M, Lee S, Yang SK, et al. Differential expression in histologically normal crypts of ulcerative colitis suggests primary crypt disorder [J]. Oncology Reports, 2006, 16(4): 663.

[ 7 ] Wang L, Hahnloser D, Boardman LA, et al. Loss of expression of zymogen granule protein 16 in colorectal cancer [J]. Cancer Research, 2005, 65(9):452.

[ 8 ] Cullen, Bryan R. Transcription and Processing of Human microRNA Precursors [J]. Molecular Cell, 2004, 16(6): 861-865.

[ 9 ] Angie M, Cheng MWB, Jeffrey Shelton, et al. Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis [J]. Nucleic Acids Research, 2005, 33(4): 1290-1297.

[ 10 ] Kimchi ET, Posner MC, Park JO, et al. Progression of Barrett’s Metaplasia to Adenocarcinoma Is Associated with the Suppression of the Transcriptional Programs of Epidermal Differentiation [J]. Cancer Research, 2005, 65(8): 3146-3154.

[ 11 ] Liu X, Lu K, Wang K, et al. MicroRNA-196a promotes non-small cell lung cancer cell proliferation and invasion through targeting HOXA5 [J]. BMC Cancer, 2012, 12(1): 348.

[ 12 ] Sun M, Liu XH, Li JH, et al. MiR-196a is upregulated in gastric cancer and promotes cell proliferation by downregulating p27(kip1) [J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2012, 11(4): 842.

[ 13 ] Tsai MM, Wang CS, Tsai CY, et al. Circulating microRNA-196a/b are novel biomarkers associated with metastatic gastric cancer [J]. European Journal of Cancer, 2016, 64: 137-148.

[ 14 ] Cappello F, David S, Rappa F, et al. The expression of HSP60 and HSP10 in large bowel carcinomas with lymph node metastase [J]. BMC Cancer, 2005, 5(1): 139.

[ 15 ] Pfister K, Radons J, Busch R, et al. Patient survival by Hsp 70 membrane phenotype: association with different routes of metastasis [J]. Cancer, 2007, 110(4): 926-935.

[ 16 ] Fariñasarasqueta A, Lijnschoten GV, Moerland E, et al. The BRAF V600E mutation is an independent prognostic factor for survival in stage II and stage III colon cancer patients [J]. Annals of Oncology, 2010, 21(12): 2396.

[ 17 ] Massey AJ, Williamson DS, Browne H, et al. A novel, smallmolecule inhibitor of Hsc70/Hsp70 potentiates Hsp90 inhibitor induced apoptosis in HCT116 colon carcinoma cells [J]. Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2010, 66(3): 535-545.

[ 18 ] Zhao Y, Oki E, Ando K, et al. The impact of a high-frequency microsatellite instability phenotype on the tumor location-related genetic differences in colorectal cancer [J]. Cancer genetics and cytogenetics, 2010, 196(2): 133-139.

[ 19 ] Clancy C, Burke JP, Kalady MF, et al. BRAF mutation is associated with distinct clinicopathological characteristics in colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis [J]. Colorectal disease : the off i cial journal of the Association of Coloproctology of Great Britain and Ireland, 2013, 15(12): 711-718.

[ 20 ] 杨姣, 傅健飞, 钟献, 等. 左右半大肠癌的差异 [J]. 国际肿瘤学杂志, 2015, 42(4): 305-308.

Expression and their clinical significance of miR-196a and ZG16 in colorectal cancer and their correlations

Fan Xinxin, Zhao Qingfang, Guan Lulu, Liu Qi, Wang Maoxun, Lyu Huifang, Chen Xiaobing. Oncology Department, The Af fi liated Cancer Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China Corresponding author: Chen Xiaobing, Email: 2290773710@qq.com

Testing the expression of ZG16 mRNA and miR-196a of colorectal cancer tissue and the adjacent normal tissue to investigate the correlation between the two markers and detect their relationship with clinical pathological features of patients. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression level of miR-196a and ZG16 mRNA in cancer tissue and its paired adjacent normal tissue sample from 83 CRC patients. The correlation of the two markers and their relative expression level with clinical-pathological features were also analyzed. Results The realative expression of ZG16 mRNA was signif i cantly lower in CRC tissues compared with adjacent normal tissue samples (t=-27.511, P＜0.001); and the relative expression of miR-196a was signif i cantly higher in cancer tissue compared with adjacent normal tissue samples (t=9.04, P＜0.001), and the relative expression of ZG16 mRNA has a signif i cantly negative correlation with the relative expression of miR-196a (P＜0.001, r=-0.469); The expression of miR-196a is related to tumor location, lymph node metastasis distant metastasis and tumor stages (P＜0.05), and its expression has no relationship with sex, age, the state of CEA, tumor size, differentiation degree or inf i ltration depthof CRC samples (P＞0.05). The same results was found in the expression of ZG16 mRNA. Conclusions Both of miR-196a and ZG16 mRNA may promote the occurrence of colorectal cancer, and suggests that they two may be potential biomarkers for disease and curative effect evaluation. Both of the expression of the two are different in left and right CRC, which may be helpful for individual treatment.

Colorectal neoplasms; MiR-196a; ZG16 protein; Clinical pathology

2017-04-07）

（本文编辑：杨明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.04.006

河南省杰出青年基金项目（No.144100510008）

450000 郑州大学附属肿瘤医院肿瘤内科

陈小兵，Email：2290773710@qq.com

樊鑫鑫, 赵青芳, 关露露, 等.MiR-196a与ZG16蛋白在结直肠癌中的表达意义及相关性分析[J/CD].中华结直肠疾病电子杂志, 2017, 6(4): 294-300.