HPLC法测定八角莲中3种活性成分含量的研究

徐怡++邱斌++熊永兴++苏钛++李云

摘要：目的建立用高效液相色谱法测定八角莲中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的方法，比较不同产地八角莲药材3种化合物的含量。方法色谱柱：Waters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流动相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；检测波长：290 nm；进样量：10 μL；柱温30℃。结果槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的线性范围分别为000973 μg-973 μg（r=09999）、001001 μg-1001 μg（r=09999）、000998 μg-998 μg（r=09999），平均回收率分别为9835%（RSD=26%）、10025%（RSD=23%）、10080%（RSD=27%）。结论该方法简便可行，重复性好，可用于同时测定八角莲药材中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素3种成分的含量，为八角莲药材的质量控制提供依据。

关键词：八角莲；槲皮素；鬼臼毒素；山柰素；高效液相色谱法

中图分类号：R9272文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）07-0065-03

八角莲（Dysosma versipellis Hance MCheng）隶属于小檗科（Berberidaceae）八角莲属（Dysosma Woodson），为我国特有二级濒危保护植物，主要分布在四川、云南、广西和湖北神农架林区及周边地区[1-2]，其根和根茎入药，有清热解毒、化痰散结、祛瘀消肿之功效。用于治疗痈疖肿痛、毒蛇咬伤、风湿关节痛、半身不遂、气管炎、乙型肝炎等，也可做杀虫剂。其主要有效成分有木脂素类物质鬼臼毒素及其衍生物、黄酮类物质山柰素和槲皮素等。现代药理研究表明[3-6]，鬼臼毒素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用；黄酮类成分则在心血管系统、内分泌系统和抗肿瘤方面具有明显的药理作用。目前对八角莲中有效成分的含量测定研究仅限于鬼臼毒素，且对不同产地八角莲中鬼臼毒素、槲皮素、山柰素等三种有效成分的含量比较尚未见报道。本文采用高效液相色谱法同时测定八角莲中三种成分的方法，为客观评价八角莲药材质量提供了科学依据。

1仪器与试药

11仪器美国Agilent 1100高效液相色谱仪（四元泵、DAD检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及化学工作站）；恒温水浴锅；梅特勒-托利多AG285电子天平。

12试药十二批八角莲药材由云南省药物研究所收集，经中国科学院昆明植物研究所李恒研究员鉴定为小檗科植物八角莲Dysosma versipellis（Hance）MCheng，见表1。

对照品槲皮素（批号：100081-200406，纯度973%）、鬼臼毒素（批号：111645-200301）、山柰素（批号：110861-200304）均由中国药品生物制品检定所提供；所用流动相甲醇、磷酸为色谱纯，处理样品的甲醇为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

21色谱条件色谱柱：Wasters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流动相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；检测波长：290 nm；进样量：10 μL；柱温30℃，理论塔板按槲皮素计算不低于4000，在该色谱条件下，供试品、对照品分离较好，与其他杂质峰均能达到基线分离（见图1）。

22溶液的制备

221对照品溶液的制备精密称取对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含槲皮素01 mg，鬼臼毒素01 mg，山柰素01 mg的溶液，作为对照品溶液。

222供试品溶液的制备取样品05 g（过4号筛），精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，精密量取甲醇25 mL，称重，80℃水浴回流30 min，放至室温后，用甲醇补重，摇匀，用045 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

23线性关系考察精密称取槲皮素1000 mg，鬼臼毒素1001 mg，山柰素998 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0973 mg/mL、1001 mg/mL、0998 mg/mL的混合标准品储备液。精密吸取此储备液逐级稀释，分别注入液相色谱仪中，以对照品含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。得回归方程为：Y槲皮素=14109X+18353，r=09999；Y鬼臼毒素=4837X +9504，r=09999；Y山奈素=15916X+16558，r =09999。結果表明，在上述色谱条件下，槲皮素在000973μg～973μg，鬼臼毒素在001001μg～1001μg，山柰素在000998μg～998μg范围内呈良好的线性关系。

24准确度试验（加样回收试验）精密称取9份样品（已测槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量分别为00645%、0125%、0241%，每份约025 g），分别添加适量对照品（含量的50%、100%、150%），然后按供试品溶液处理方法同法处理，将处理好的供试品溶液按含量测定方法同法测定，计算：槲皮素平均回收率=9835%，RSD=26%（n=9）、鬼臼毒素平均回收率=10025%，RSD=23%（n=9）、山柰素平均回收率=10080%，RSD=27%（n=9）。

25精密度试验

251仪器精密度取混合对照品溶液（槲皮素00973 mg/mL、鬼臼毒素01001 mg/mL、山柰素00998 mg/mL），按照“21”项色谱条件，连续进样6次，进样10μL，记录峰面积，RSD%分别为11%、12%、082%（n=6），结果表明仪器精密度较好。

252重复性试验取同一样品按“222”项平行制备供试品6份，按照“21”项色谱条件进样，测定结果，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的RSD分别为：29%、24%、22%，表明本法具有良好的重复性（RSD3%）。

26稳定性试验取同一份样品溶液，按“21”项色谱条件，分别于0、3、6、16、20h进样，测定峰面积，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素峰面积的RSD%（n=5）分别为：091%、079%、059%，结果表明供试品溶液在20 h内稳定。

27样品测定取12批样品按上述供试品制备方法制备，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述“21”项色谱条件测定，记录峰面积，以外标法计算样品中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的含量，结果见表2。

3讨论

本试验参考了有关文献[7-9]，对提取方法、提取溶剂、提取时间分别作单因素考察，最终确定了供试品溶液的制备方法为甲醇回流提取法。通过对三种成分的甲醇溶液进行全波长扫描，结果槲皮素、山柰素在254 nm、360 nm处有最大吸收，但鬼臼毒素的最大吸收波长为290 nm，考虑到槲皮素和山柰素的响应值偏高，且鬼臼毒素在其他两个波长下吸收值均不理想，故选择290 nm为检测波长，实验表明该波长检测灵敏度高，杂质吸收峰少，干扰小，效果理想。

本研究建立了八角莲中三个主要化学成分的高效液相色谱定量分析方法。该方法专属性强，精密度、稳定性和重现性好，可为八角莲质量标准的研究及种质资源评价建立基础。

从12批不同产地的样品测定结果可以看出，各地八角莲三个成分含量存在较大差异。其中，湖北、江西、安徽等地的八角莲样品鬼臼毒素含量明显高于云南、四川等地。影响药材品质的因素很多，主要有产地、采收期、加工方法等。本文收集的样品有限，一定程度上影响了研究的深度，后续将扩大样本量，并對其他影响因素与含量间的相关性开展更深入研究。

参考文献：

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