西藏拉鲁湿地土壤酵母菌多样性及产胞外酶活性菌株分布特性研究

郝 兆，梁泽鹏，熊 宁，拉 巴，德 吉，郭小芳

（西藏大学理学院，西藏 拉萨 850000）

西藏拉鲁湿地土壤酵母菌多样性及产胞外酶活性菌株分布特性研究

郝 兆，梁泽鹏，熊 宁，拉 巴，德 吉，郭小芳

（西藏大学理学院，西藏 拉萨 850000）

采用平板稀释法从西藏拉鲁湿地土壤中分离酵母菌，开展城市湿地酵母菌多样性研究。结合经典分类法及26S rDNA D1/D2区域序列分析，对获得的酵母菌菌株进行系统分类，并进行产胞外酶活性菌株的皿内初筛。结果显示，分离得到的83株酵母菌分属于隐球菌属Cryptococcus、假丝酵母属Candida、原囊菌属Protomyces、红酵母属Rhodotorula及孢囊线黑粉酵母Cystofilobasidium等5个属16个种，其中胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa相对丰度最高，约26%，其次为维多利亚隐球酵母Cryptococcus victoriae和山杨隐球酵母Cryptococcus aspenensis；多样性分析表明，LhWS6样点的酵母菌多样性最丰富，LhWS9样点则最低；产胞外酶活性菌株初筛结果表明，25℃下产脂肪酶活性菌株比例最高，为67%，而4℃下产淀粉酶活性菌株数最多，为49株。另外，低温条件下产淀粉酶、果胶酶、纤维素酶和几丁质酶的活性菌株比例均高于常温条件。结果表明拉鲁湿地土壤酵母菌总体种类较丰富，但每个样点的种类相对单一，说明湿地生境或人为活动一定程度影响到该生态环境酵母菌的种群分布，开发青藏高原耐低温、产胞外酶等活性菌株具有一定的应用前景。

拉鲁湿地；土壤；酵母菌多样性；26 SrDNA D1/D2

微生物是生物地球化学循环的主要驱动者，其群落组成和活性影响着生态系统转化的方向和进程［1］。开展微生物多样性及其功能特性研究对于阐明微生物群落与其生境的关系、开发微生物资源意义显著。

青藏高原是世界上海拔最高、面积最大而独特的生态系统，高寒、缺氧、辐射强等因素相互作用形成了其特殊的自然地理环境，同时孕育了大量丰富而特殊的微生物资源。国内外学者对青藏高原微生物多样性开展了较为广泛的研究［2］，但其中酵母菌的研究未见文献报道。

湿地为水生、陆生生态系统界面相互延伸扩展的重叠空间区域，是地球上特殊过渡类型生态系统，也是自然界富有生物多样性的生态景观和人类重要的生存环境之一，具有多种生态功能和社会经济价值，被誉为“自然之肾”［3］。微生物是湿地生态系统的重要组成部分，不仅在湿地生态系统物质循环、能量流动和系统稳定性维持等方面具有重要作用，而且还参与废物处理、生态修复、气体调节和生物多样性保护等生态过程［4］。拉鲁湿地是目前我国城市范围内面积最大的天然湿地，其在保持地区生物多样性、维持城市生态平衡、改善城市环境质量等方面起着十分重要的作用，故有拉萨“城市之肺”之称［5］。尽管拉鲁湿地具有重要的生态作用，但是由于地域等条件的限制，对其中生物资源和多样性的研究起步比较晚，且主要集中在植物群落结构［6］、土壤动物［7-11］、昆虫资源［12］、鸟类［13-14］及鱼类多样性［15］等的研究，而微生物方面仅见零星报道，也仅局限于土壤放线菌和细菌的研究［16-17］，拉鲁湿地酵母菌相关研究则尚未开展。本研究旨在开展拉鲁湿地土壤酵母菌多样性及产胞外酶活性菌株筛选等研究，期望为青藏高原酵母菌资源的开发利用及菌种资源库的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样点设置

在拉鲁湿地保护区（91°05′54″～91°06′16″E，29°40′02″～29°41′01″N）设置10个样点，各样点地理位置及生境见表1，采样点见图1。

表1 拉鲁湿地土壤采样点概述

图1 拉鲁湿地土壤采样点分布

1.2 土样采集

2015年10月份，在拉鲁湿地选择植被类型具有代表性的10 个样点进行土样采集。每个样点设置3 m×6 m样方，去除样方表面杂质，采用多点混合法采集0～30 cm深度的土壤样品，装入无菌密封袋中，带回实验室及时进行酵母菌的分离。

1.3 酵母菌的分离纯化及保藏

取土样10 g，加入无菌水90 mL，振荡20 min制成土壤菌悬液。分别稀释至10-2、10-3并取200 μL涂布于酸化YPD、酸化YM及酸化PDA平板上，培养3～5 d后逐一记录酵母菌菌落数，并采用平板划线法在YPD培养基上进行纯化，用甘油管保藏纯化的菌株。

1.4 酵母菌的分类鉴定

采用形态观察和26 SrDNA D1/D2区域序列分析相结合的方法进行菌株鉴定。供试菌株26 S rDNA D1/D2测序结果采用DNAStar软件进行图谱分析，对序列进行人工校对后在GenBank核酸序列数据库中进行同源性搜索（BLAST search）。然后选取与供试菌株关系较近的模式菌株的26 SrDNA D1/D2区域序列比较其相似程度，并 确定菌株的分类地位。

1.5 产胞外酶活性酵母菌菌株初筛

利用模拟仿真的方法对提出模型的性能进行测试和比较分析。失踪物体在落水后，将会在风、流和浪等自然环境因素的影响下离开初始事故地点[11]，当漂移到岸边后，将会由于水深较浅而停留在岸边。

1.5.1 酵母菌菌株活化 将甘油管内保藏的酵母菌株涂布在YPD斜面上，室温或25℃培养24～72 h。

1.5.2 培养基平板制备 淀粉酶培养基：可溶性淀粉20 g，蛋白胨20 g，酵母粉 10 g，曲利酚蓝溶液（1.0%）10 mL，琼脂20 g，水1 000 mL。纤维素酶培养基：羧甲基纤维素钠2 g，硫酸铵 2 g，硫酸镁0.5 g，磷酸氢二钾1 g，氯化钠0.5 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，水1 000 mL。脂肪酶培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，吐温80 10 g，琼脂20 g，水1 000 mL。果胶酶培养基：果胶4 g，蛋白胨10 g，氯化钠0.5 g，刚果红0.15 g，琼脂20 g，水1 000 mL。几丁质酶培养基：胶状几丁质15 g，酵母粉5 g，（NH4）2SO41 g，MgSO45H2O 0.3 g，KH2PO41.36 g，水1 000 mL。

1.5.3 活性菌株初筛 将活化后的酵母菌接种于5 种产酶菌株筛选培养基，分别于4℃培养21 d、25℃培养5 d后，观察透明圈或晕圈大小，并记录结果。

1.6 数据处理

试验数据采用Excel软件计算Shannon-Wiener多样性指数（H’）、Pielou均匀度指数（J’）及Simpson多样性指数（D）。

2 结果与分析

2.1 拉鲁湿地土壤中酵母菌群落组成分析

利用经典分类法及 26SrDNA D1/D2区域序列分析法对拉鲁湿地土壤中的酵母菌其进行鉴定，结果（表2）显示，担子菌纲（3个属14个种）相对丰度高达99.57%，而子囊菌纲仅包括2个属2个种，相对丰度仅为0.43%，可以看出，拉鲁湿地土壤中，担子菌纲酵母占明显优势。由表2可知，拉鲁湿地土壤酵母菌分属5个属16 种，其中隐球菌属种类最多，为8个种，其次为红酵母属（4个种），孢囊线黑粉酵母Cystofilobasidium为2个种，原囊菌属和假丝酵母属均为1个种。

酵母菌属水平相对丰度以红酵母属最高、为46.77%，其次为隐球菌属（44.75%），而原囊菌属、假丝酵母属相对丰度最低（均为0.22%），表明隐球菌属和红酵母属是拉鲁湿地土壤中酵母菌的优势属。酵母菌种水平相对丰度以胶红酵母最高、为25.86%，其次为维多利亚隐球酵母Cryptococcus victoriae（17.03%）和山杨隐球酵母Cryptococcus aspenensis（14.65%），而假丝酵母Candida sake、气生隐球酵母Cryptococcusaerius、鹿角原囊菌Protomycesinundatus均只分离到1株，相对丰度只有0.22%。Cryptococcus victoriae分布相对广泛，出现频率为50%，其次为粘红酵母Rhodotorulaglutinis，出现频率为40%，Cryptococcus aspenensis、胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa、香草红酵母Rhodotorulavanillica分布不太广泛，出现频率仅为20%，而其余11种酵母均仅分布于一个样点。

表2 拉鲁湿地土壤酵母菌种群分布状况

2.2 拉鲁湿地不同样点土壤酵母菌组成相似性分析

表3表明，除LhWS3与LhWS5、LhWS8，LhWS8与LhWS5、LhWS7间相似性系数为0.5，属于中度相似外，其他样点间的Jaccard相似性系数均分布于0～0.25，属于极不相似，尤其是样点LhWS9、LhWS10与其他各样点之间相似性系数均为0。总体而言，拉鲁湿地各个样点土壤酵母菌种群分布差异较大。

表3 拉鲁湿地不同土壤样点酵母菌种类Jaccard相似性系数

2.3 拉鲁湿地土壤酵母菌多样性分析

从表4可以看出，拉鲁湿地每个土壤样品中分离的酵母菌种类均不多，最多为3 种，最少的为1种（LhWS9样点）；LhWS6样点可培养酵母菌数量最多，其次为LhWS2样点，LhWS9样点则最少，仅为5×102CFU/g。

Shannon-Wiener多样性指数以LhWS6样点最高，为1.10，其次为LhWS7和LhWS2样点，均超过0.90，LhW3、LhWS5、LhWS10 3个样点介于0.80～0.90之间，LhWS9样点最低（仅为0），LhWS8样点也较低；Simpson多样性指数以LhWS6样点最高，LhWS9为最低；Pielou均匀度指数除LhWS9样点为0外，其他样点间差距不明显。综合3种多样性指数可以看出，LhWS6样点土壤酵母菌多样性最丰富且多样，其次为LhWS7和LhWS2样点，LhWS9样点酵母菌分布明显单一，LhWS8样点酵母菌多样性也不太丰富。

表4 拉鲁湿地不同土壤样点酵母菌多样性指数

2.4 拉鲁湿地土壤产胞外酶活性酵母菌分布特性

2.4.1 拉鲁湿地土壤16种酵母菌产胞外酶活性菌株数比较 表5结果显示，被测的83株酵母菌中，4℃条件下，产淀粉酶活性菌株最多（49株），其次为产脂肪酶活性菌株，而产几丁质酶活性菌株数则最少，仅占总菌株的4%。除仅分离到1株的5种酵母菌外，产淀粉酶活性菌株比例最高的为Rhodotorulavanillica，其次为Cryptococcus aspenensis、粘红酵母Rhodotorula glutinis、Cryptococcus victoriae；产脂肪酶活性菌株比例最高的为Rhodotorulaglutinis，比例高达82%，其次为Cryptococcus victoriae（61%）；产纤维素酶活性菌株比例最高的为乌兹别克斯坦酵母Cryptococcusuzbekistanensis，其次为阿德利隐球酵母Cryptococcusadeliensis、乳酪隐球酵母Cryptococcusfriedmannii；产果胶酶活性菌株比例最高为禾谷隐球酵母Cryptococcuscerealis、其次为胶红酵母Rhodotorula mucilaginosa。比较占优势的两个属的产胞外酶活性菌株比例可以看出，红酵母Rhodotorula产淀粉酶和产脂肪酶活性菌株比例高于隐球酵母Cryptococcus，Cryptococcus产果胶酶活性菌株比例较高，Rhodotorula和Cryptococcus产纤维素酶活性菌株差不多，产几丁质酶的活性菌株均为Cryptococcus。

表6结果表明，25℃条件下，产脂肪酶活性菌株最多，比例为61%，其次为产淀粉酶活性菌株，而产几丁质酶活性菌株则没有。比较占优势的两个属的产胞外酶活性菌株比例，可以看出，Cryptococcus产脂肪酶活性菌株比例较高，而产淀粉酶活性菌株比例则相反，果胶酶和纤维素产生能力两者差不多。分析产不同胞外酶活性菌株比例（除仅分离到1株的5种酵母菌外），可以看出，产淀粉酶活性菌株比例最高的为Cryptococcusfriedmannii和Cryptococcuscerealis，

其次为Rhodotorulavanillica；产脂肪酶活性菌株比例最高的为Cystofilobasidium macerans（100%） ，其次为Rhodotorulaglutinis（94%），Cryptococcus victoriae产脂肪酶活性菌株比例也比较高，为72%；产纤维素酶活性菌株比例最高的为Cryptococcuscerealis、其次为Cryptococcus adeliensisi；产果胶酶活性菌株比例最高为浸麻孢囊线黑粉酵母Cystofilobasidium macerans，其次为Cryptococcusuzbekistanensis。

表5 拉鲁湿地土壤中不同酵母菌产胞外酶活性菌株数比较（4 ℃）

表6 拉鲁湿地土壤中不同酵母菌产胞外酶活性菌株数比较（25 ℃）

比较不同温度下拉鲁湿地产胞外酶活性菌株，从表5、表6可以看出，25℃条件下，产脂肪酶活性菌株比例明显高于低温条件，相反，4℃条件下产淀粉酶、纤维素酶及果胶酶活性菌株比例则高于25℃，另外，产几丁质酶活性菌株则只在4℃条件下被筛选到。

2.4.2 拉鲁湿地不同样点土壤酵母菌产胞外酶活性菌株数比较 从表7可以看出，4℃条件下，几丁质酶活性菌株主要出现在LhWS4和LhWS5样点，产淀粉酶活性菌株比例最高的样点为LhWS3、LhWS9和LhWS10，均为100%，产脂肪酶菌株比例最高的样点则为LhWS3和LhWS7，而LhWS5样点产果胶酶活性菌株比例最高，LhWS2样点产纤维素酶活性菌株比例最高。另外，LhWS9和LhWS10样点仅有淀粉酶活性菌株被筛选到。

表7 拉鲁湿地不同样点土壤酵母菌产胞外酶活性菌株数比例（%，4℃）

表8数据显示，25℃产淀粉酶活性菌株比例最高的样点为LhWS2，其次为LhWS3、LhWS5和LhWS7样点；产脂肪酶菌株比例最高的样点则为LhWS7，其次为LhWS3、LhWS2和LhWS1样点；而LhWS3样点产纤维素酶和果胶酶活性菌株比例最高。另外，LhWS9样点未检测到产5种胞外酶活性菌株，LhWS10仅有产淀粉酶活性菌株被筛选到。

表8 拉鲁湿地不同样点土壤酵母菌产胞外酶活性菌株数比例（%，25℃）

比较表7和表8数据可以发现，除LhWS3以及未筛选出脂肪酶活性菌株的LhWS9和LhWS10样点外，其他7个样点高温条件下的产脂肪酶活性菌株比例均高于低温条件；而产淀粉酶活性菌株比例除LhWS2样点外，其他样点低温条件下的产脂肪酶活性菌株比例均不低于高温条件；产纤维素酶活性菌株比例除LhWS6样点外，其他样点低温条件下活性菌株比例仍均不低于高温条件；产几丁质酶活性菌株仅于低温条件下，在LhWS4和LhWS5样点被分离到。

3 结论与讨论

分离自拉鲁湿地土壤83株酵母菌，经26 SrDNA D1/D2区域序列分析法进行鉴定，被归为5个属16个种。多样性分析结果显示，LhWS6样点多样性指数最高，LhWS9样点酵母菌最为单一；Jaccard相似性系数显示，LhWS3样点与LhWS5、LhWS8样点之间相似性系数为0.5，LhWS8样点与LhWS5样点、LhWS7 样点也属于中等相似。分析这些样点的采样生境，可以看出，它们都属于人类活动影响相对明显的生境；而LhWS9样点为沙石冲击区、LhWS10样点属于沼生群落生境，特殊的生境可能是导致它们与其他样点酵母菌种类极不相似的原因。

由于湿地土壤酵母菌多样性研究未见相关文献报道，只能将青藏高原其他高海拔地区土壤酵母菌与本研究的结果进行分析比较。徐美鑫等［18］研究了青海东部土壤的酵母物种多样性，从青海的互助、民和、门源等10个州县收集土样并分离得到98株酵母菌，26 S rDNA D1/D2区域序列分析结果显示，这些酵母菌分属于10个属13个种。分析两个不同地域酵母菌种类，可以看出，除3种酵母菌（Cryptococcus aerius、Cryptococcu.uzbekistanensis、Rhodotorula mucilaginosa）为共同存在的种类外，其他的都不同。比较本研究发现，拉鲁湿地土壤酵母菌属数虽然不多，但种数却明显多于青海同一地区土壤中酵母菌（最多为10 种），说明拉鲁湿地酵母菌总体上多样性比较丰富。然而就每个样点而言，种类相对单一，最多为3种，个别样点仅分离到1株酵母，因此尽快开展青藏高原相对脆弱生态环境微生物资源的开发利用至关重要。

LhWS9和LhWS10样点酵母产胞外酶活性结果表明，这3个样点低温条件下除淀粉酶外，不能产生其他4种胞外酶，可能与样点所处生境及植被类型有一定关系，这些样点相对植被覆盖度较低甚至无植物生长，导致其中营养物质可能贫乏，因此酵母菌产胞外酶的类型相对单一。另外，LhWS7样点无论低温还是常温条件下，产脂肪酶活性菌株比例明显较高，这可能是因为该样点为拉萨市城关区居民生活污水进入拉鲁湿地的入水处，其中含有的物质或生活垃圾等的堆积导致该样点产脂肪酶酵母菌比例高于其他样点。总体而言，虽然采样点分布较集中，但是因为各个样点生境类型具有一定的特色，因此各个样点间相似性相对较低，绝大多数样点间呈极度不相似。此结果从某种程度上说明，微生物所处生境类型或人类活动会一定程度地影响其种群分布。

考虑到拉鲁湿地地处高原高寒、缺氧条件，可能会存在更多耐低温的酵母菌，因此在筛选产胞外酶活性菌株时，本研究设置25、4℃两种条件进行。结果显示，低温条件下50%以上（49株）酵母菌能够至少产1种胞外酶，其中10株酵母菌能够产生3种胞外酶。本研究结果还表明，产脂肪酶活性菌株比例25℃条件下高于低温条件，相反，4℃条件下产淀粉酶、纤维素酶及果胶酶活性菌株比例则高于25℃，另外，产几丁质酶活性菌株则只在4℃条件下被筛选到。这一方面可能是因为高原环境更有利于耐低温酵母菌菌株的生存，另外，也与我们在分离过程中采用的培养温度有关，其中有32株酵母菌活化时仅在拉萨秋冬季室温下生长，而不能在25℃恒温条件下得到活化。因此，开发青藏高原耐低温、产胞外酶或其他特殊功能的酵母菌资源具有广阔的前景。

［1］ 褚海燕. 高寒生态系统微生物群落研究进展［J］. 微生物学通报，2013，40（1）：123-136.

［2］ 孔维栋. 极地陆域微生物多样性研究进展［J］.生物多样性，2013，21（4）：456-467.

［3］ Zhang Y L，Wang C L，Bai W Q，et al. Alpine wetlands in the Lhasa River Basin，China［J］. Journal of Geographical Sciences，2010，20（3）：375-388.

［4］ 刘银银，李峰，孙庆业，等. 湿地生态系统土壤微生物研究进展［J］. 应用与环境生物学报，2013，19（3）：547-552.

［5］ 黄薇，陈叙图. 拉鲁湿地的生态服务功能及其退化原由的分析［J］. 西部林业科学，2008，37（3）：41-45.

［6］ 拉多，John Birks，普布，等. 拉萨市拉鲁湿地植物群落与环境因素之间的关系及其分布格局［J］. 西藏大学学报（自然科学版），2009，24（1）：15-20.

［7］ 巴桑，普布，马正学，等. 西藏拉鲁湿地夏季和秋季浮游藻类群落特征［J］. 湿地科学，2012，10（4）：404-416.

［8］ 陈德来，马正学，普布，等. 拉萨拉鲁湿地夏季土壤动物的群落特征［J］. 动物学杂志，2011，46（5）：1-7.

［9］ 巴桑，黄香，普布，等. 拉鲁湿地夏秋季纤毛虫群落特征及其与水环境的关系［J］. 生态学杂志，2014，33（10）：2740-2748.

［10］ 陈德来，普布，巴桑，等. 西藏拉鲁湿地夏季土壤线虫群落特征［J］. 动物学杂志，2014，49（5）：744-753.

［11］ 巴桑，普布. 拉鲁湿地自然保护区有壳肉足虫物种多样性与空间分布特征［J］. 西藏大学学报（自然科学版），2014，29（1）：1-7.

［12］ Chen L Y，Zhao X L，Ma H G，et al. Morphology，morphogenesis and molecular phylogeny of a soil ciliatePseudouroleptus caudatus caudatus Hemberger，1985（Ciliophora，Hypotricha），from Lhalu Wetland，Tibet［J］. European Journal of Protistology，2015，51：1–14.

［13］ 普布，孙扩，张二豪，等. 拉鲁湿地夏季昆虫群落组成特征的初步研究［J］. 西藏大学学报（自然科学版），2013，28（1）：7-11.

［14］ 巴桑，次仁，普布，等. 拉鲁湿地国家级自然保护区鸟类资源及其保护对策［J］，资源科学，2009，31（7）：1238-1243.

［15］ 范丽卿，土艳丽，李建川，等. 拉萨市拉鲁湿地鱼类现状与保护［J］. 资源科学，2011，33（9）：1742-1749.

［16］ 何建清，张格杰，岳海梅. 拉鲁湿地自然保护区放线菌组成分析及生物活性测定［J］. 微生物学杂志，2009（4）：6-10.

［17］ 德吉，吴小妮，索朗德庆，等. 拉鲁湿地土壤细菌多样性初探［J］. 西藏大学学报（自然科学版），2014，29（2）：44-50，

［18］ 徐美鑫，刘天明，相茂功，等. 青海东部土壤中酵母物种多样性研究［J］. 微生物学通报，2009，36（3）：360-364.

（责任编辑 邹移光）

Yeast diversity and distribution characteristics of activity strains producing extracellular enzyme in soil of Lhalu Wetland，Tibet

HAO Zhao，LIANG Ze-peng，XIONG Ning，LA Ba，DE Ji，GUO Xiao-fang
（School of Science，Tibet University，Lhasa 850000，China）

In this paper，we isolated yeasts from soil of Lhalu Wetland using the dilution method. In addition，we used 26S rDNA D1/D2 domain sequence analysis and traditional methods to identify isolates and screened extracelluar enzyme activity strains in petri dish. 83 yeast isolates were identified as belonging to 16 species of 5genera，includingCryptococcus，Candida，Protomyces，RhodotorulaandCystofilobasidium.R. mucilaginosawas the most species in soil of the wetland，moreover，the relative abundance ofCryptococcus victoriaeandCryptococcus aspenensiswas also high. Diversity indices showed that yeast isolates in the LhWS6 site were most abundant，however，that of the LhWS9 site were the lowest. The study showed that human activities had influences on spatial dynamics of yeast community in Lhalu Wetland. The test also manifested that the percentage of lipase activity strains was the highest at 25℃，however，the number of strains produced amylase most at 4℃，up to 49 isolates. Furthermore，the percentage of isolates producing amlyse，pectinase，cellulase and chitinase was higher in cold condition. Yeasts distributing in soil of Lhalu Wetland were abundant，but insingle site，the kind was few，which indicated that the wetland habitat or human activity could effect population distribution，and it was important to exploit low temperature-tolerant or exoenzyme activity microorganism in Qinghai-Tibet plateau.

Lhalu Wetland; soil; yeast diversity; 26 SrDNA D1/D2

S154.3

A

1004-874X（2017）04-0099-09

郝兆，梁泽鹏，熊宁，等. 西藏拉鲁湿地土壤酵母菌多样性及产胞外酶活性菌株分布特性研究［J］.广东农业科学，2017，44（4）：99-107.

2016-10-12

国家级大学生创新创业训练项目（201510694003）；西藏自治区自然科学基金（2016ZR-15-11）；2016年度西藏大学珠峰学者人才发展支持计划（藏大字［2016］141号）

郝兆（1995-），男，在读本科生，E-mail：51392080@qq.com

郭小芳（1982-），女，硕士，副教授，E-mail：gxf005@hotmail.com