许帅,贾美清,孟元,苟娟,黄静,张国刚*
(1.天津师范大学生命科学学院,天津300387;2.天津师范大学,天津市水资源与水环境重点实验室,天津300387)
天津海底吹填淤泥中可培养细菌对黑麦草种子萌发及植株生长发育的影响
许帅1,贾美清2,孟元1,苟娟1,黄静1,张国刚1*
(1.天津师范大学生命科学学院,天津300387;2.天津师范大学,天津市水资源与水环境重点实验室,天津300387)
天津海底淤泥中含有丰富的微生物资源,这些微生物随着天津港排淤及吹填造地过程进入陆地生态系统。为明确这些微生物对陆地草坪植物的影响,选择已经分离并鉴定的14株可培养细菌作为试材,研究了其对黑麦草种子萌发及植株生长的影响。结果表明:海底淤泥中的海水芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌对黑麦草种子萌发及植株生长均有促进作用;丁香假单胞菌和特氏盐芽孢杆菌对黑麦草种子萌发无显著影响,但对黑麦草植株生长有促进作用;盐单胞菌、苏云金芽孢杆菌、西伯利亚微小杆菌和海洋芽孢杆菌对黑麦草种子萌发及植株生长的影响均不大;洋葱伯克霍尔德菌、巴氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和类芽孢杆菌对黑麦草种子萌发影响不显著,但对黑麦草植株生长有明显的抑制作用。本研究结果为开发利用海底淤泥中的微生物资源,进一步解决吹填造陆区域绿化难题提供了理论依据。
天津;吹填淤泥;可培养细菌;黑麦草;种子萌发;植株生长
天津港位于渤海湾西岸的海河入海口处,属于典型的淤泥质海岸[1]。为了保持航道通畅,港口每天都要采取多项减淤措施,从海底吸出大量的淤泥以疏浚航道。这些淤泥被大量用于吹填造地,以解决土地不足的问题。近年来,天津的航道疏浚淤泥吹填造地面积逐年增加,已达352.78 km2,但由于其缺少土壤的生态功能,所增加的国土面积不能被称为土壤,而仅是由淤泥固化而成的沉积物,常被称为“绿色植物的禁区”[2]。
海底吹填淤泥是海洋微生物最重要的生存场所,具有高盐、高碱、低温(深海、极地等区域)、高温(深海热液口)、高压(深海)、寡营养等极端特性。因此,在长期的适应与进化过程中,形成了具有适应这些极端环境的生理和代谢机制的独特微生物[3]。土壤微生物是生态系统的重要组成部分,在有机物质分解转化过程中起主导作用,是土壤生态系统中十分重要的一环[4]。大量吹填淤泥中的特有微生物进入陆地生态系统,极有可能对陆地上的草坪植物造成一定的影响,从而影响吹填区域草坪植被的生长。
目前,对吹填淤泥绿化改良的研究,主要集中在盐度、含水量、有机质含量等理化性质以及土壤质地结构方面[5]。而淤泥中微生物对草坪植物的影响,目前尚未有针对性的研究和报道。作者在明确吹填淤泥的理化性质、分离出部分可培养微生物的基础上,进一步研究了吹填淤泥中的细菌进入陆地生态系统后对草坪植物种子萌发及生长发育的影响,以期为吹填淤泥造地后的大规模绿化提供基础理论指导和生态风险评价。
1.1 供试材料
参试可培养细菌共14株(表1),均分离自天津港(北纬38°59′08″,东经117°42′05″)吹填淤泥,保藏于天津师范大学天津市水资源与水环境重点实验室冰箱中。
表1 参试细菌的编号及其分子鉴定结果Table 1 Bacteria number and molecular identification results
试验草坪草为多年生黑麦草(Lolium perenne),种子购自广州田野风园林绿化有限公司,在实验室测得种子千粒重约为3.065 g。
1.2 试验方法
1.2.1 种子处理称取黑麦草种子10 g,清洗干净,用无菌水浸泡12 h,去除漂浮在水面上的干瘪种子,选取大小一致的饱满种子用于试验[9]。
1.2.2 菌液制备将14株可培养细菌分别接种在牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5 g、无菌水1 000 mL,pH值7.4~7.6)进行培养,并用紫外-可见分光光度计每隔24 h测定1次其OD600值[10],至OD值不再变化,即为饱和菌液。然后利用血球计数板,在显微镜下分别统计各饱和菌液的细菌浓度,在3.2×107~3.777 6×108cfu/mL,为了确保试验过程中接种的各菌株用量一致,用无菌水将其稀释至106cfu/mL,作为接种菌液。
1.2.3 黑麦草种子萌发试验配制牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、无菌水1 000 mL,pH值7.4~7.6)2 500 mL。取直径9 cm的培养皿45个,倒入培养基45 mL/皿,冷却凝固后,取接种菌液200 μL分别接种于各平板上,以加入无菌水200 μL作为对照(CK),每处理均3次重复。将培养皿置于人工气候箱中,在温度28℃、相对湿度60%条件下先培养4 h。待细菌稳定附着在培养基后,各培养基铺无菌纱布2层,并放入刚浸泡过的种子50粒,加入无菌水2 mL,置于人工气候箱中,在温度28℃、相对湿度60%、光照12 h/黑暗12 h环境下进行培养[11],每天记录各处理种子的发芽数量,至第3天统计发芽率(总发芽数/种子总数×100%)。
1.2.4 黑麦草植株生长试验统计发芽率后,每处理保留幼苗20株,播种密度约为3 145株/m2。在温度28℃、相对湿度60%、光照12 h/黑暗12 h环境下培养,15 d后,用电子游标卡尺测量黑麦草幼苗的株高。然后,每皿称取黑麦草叶片100 mg,剪成长2 mm以下的细丝,放入15 mL离心管中,加入由80%丙酮与95%乙醇按体积比1∶1配制的浸提液10mL,在室温、黑暗处直接浸提叶绿素,浸提16 h后,用分光光度计分别测定645 nm和663 nm处的吸光度[12],计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。再进行刈割,测量地上部鲜重;然后105℃杀青,80℃烘干至恒重,晾凉后,测量干重。将根从纱布和培养基中抽出,测量地下部鲜重和干重[13],计算根冠比。
式中,Ca、Cb和C分别表示叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。
式中,100 mg为测叶绿素用去的叶片鲜重。
1.3 数据处理
采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析,采用LSD法进行多重比较分析,采用Sigmaplot12.5和Microsoft Excel 2007软件进行整理做图。
2.1 吹填淤泥中可培养细菌对黑麦草种子萌发的影响
不同细菌对黑麦草种子萌发的影响有所不同,但差异均不显著(图1)。接种海水芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌的培养基,黑麦草发芽率均>CK,分别较CK增加了9.33%、10.00%、8.00%、6.00%、13.33%和14.00%;接种丁香假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、西伯利亚微小杆菌、特氏盐芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌的培养基,黑麦草发芽率与CK相近;而接种盐单胞菌、巴氏芽孢杆菌的培养基,黑麦草发芽率均较CK降低10.67%。
图1 不同细菌对黑麦草种子发芽率的影响Fig.1 Effects of different bacteria on L.perenne seed germ ination
2.2 吹填淤泥中可培养细菌对黑麦草植株生长的影响
2.2.1 对黑麦草株高的影响不同细菌对黑麦草株高有显著影响(图2)。接种丁香假单胞菌、海水芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、西伯利亚微小杆菌、特氏盐芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌的培养基,黑麦草株高分别较CK增加了7.81、8.19、6.43、11.95、3.49、3.92和5.92 mm,但与CK差异均不显著;而接种盐单胞菌、海洋芽孢杆菌,对黑麦草株高几乎没有影响;接种苏云金芽孢杆菌的培养基,黑麦草株高较CK降低12.62mm,但差异不显著;而接种洋葱伯克霍尔德菌、巴氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌的培养基,黑麦草生长受到明显抑制,株高分别较CK降低了13.82、31.67、17.83和20.30 mm。
图2 不同细菌对黑麦草株高的影响Fig.2 Effects of different bacteria on plant height of L.perenne
2.2.2 对黑麦草叶绿素含量的影响叶绿素是绿色植物进行光合作用的重要物质,其含量是衡量植物光合作用的重要指标[14]。同种细菌对黑麦草叶片叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的影响一致;不同细菌对叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量的影响不同,但对总叶绿素含量的影响差异不显著(图3)。接种丁香假单胞菌、海水芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、特氏盐芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌的培养基,黑麦草叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均>CK,分别提高了18.58%~41.76%、13.92%~35.97%和17.45%~40.36%。总体来看,这6种细菌对黑麦草叶绿素b含量的影响小于对叶绿素a含量的影响,对总叶绿素含量的影响与对叶绿素a含量的影响相似。接种盐单胞菌、苏云金芽孢杆菌、西伯利亚微小杆菌、海洋芽孢杆菌的培养基,叶绿素含量与CK相近。而接种洋葱伯克霍尔德菌、巴氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌的培养基,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均<CK,分别降低了11.94%~33.83%、14.23%~40.23%和12.49%~35.38%,可以看出,这4种细菌对黑麦草叶绿素b含量的影响大于对叶绿素a含量的影响。
图3 不同细菌对黑麦草叶片叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of different bacteria on chlorophyll contents of L.perenne
2.2.3 对黑麦草生物量的影响生物量是衡量植物生长状态的重要指标。不同细菌对黑麦草地上部生物量有显著影响,且对其地上部鲜重和干重的影响并不完全一致(图4)。接种简单芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上部鲜重和干重均显著>CK,分别提高了71.86%和36.58%。接种丁香假单胞菌、巨大芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上部鲜重显著提高,分别较CK提高了44.61%和44.31%;而地上部干重变化并不显著,但分别较CK提高了21.95%和34.11%。接种海水芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上部鲜重显著提高,较CK提高了58.98%;但地上部干重却明显降低,降幅为34.14%。接种特氏盐芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上部鲜重无显著变化;但地上部干重却明显增加,增幅为36.58%。接种洋葱伯克霍尔德菌、盐单胞菌、苏云金芽孢杆菌、西伯利亚微小杆菌、海洋芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上部鲜重和干重与CK相比变化均很小,差异均不显著。而接种解淀粉芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上鲜重明显降低,降幅为38.62%;但干重无显著变化。接种巴氏芽孢杆菌和类芽孢杆菌的培养基,黑麦草地上部鲜重和干重均显著降低,其中,鲜重分别降低了60.78%和50.60%,干重分别降低了65.84%和36.58%。
图4 不同细菌对黑麦草地上部生物量的影响Fig.4 Effects of different bacteria on aboveground fresh weight and dry weight of L.perenne
与CK相比,不同细菌对黑麦草地下部生物量均有一定的促进作用(图5)。接种丁香假单胞菌、海水芽孢杆菌、盐单胞菌、苏云金芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、类芽孢杆菌的培养基,黑麦草地下部鲜重和干重均显著>CK,分别增加了44.98%~64.01%和33.33%~48.28%。接种巴氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和海洋芽孢杆菌的培养基,黑麦草地下部鲜重显著增加,增幅分别为39.03%、37.97%和39.00%;而干重变化不显著。接种洋葱伯克霍尔德菌、西伯利亚微小杆菌、特氏盐芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的培养基,黑麦草地下部生物量略有增加趋势,但与CK差异均不显著。
图5 不同细菌对黑麦草地下部生物量的影响Fig.5 Effects of different bacteria on underground fresh weight and dry weight of L.perenne
由于黑麦草样品干重较小,为减小误差,采用地下部鲜重与地上部鲜重的比值(根冠比)来表示其地上部与地下部的相关性。接种类芽孢杆菌、巴氏芽孢杆菌的培养基,黑麦草根冠比显著>CK,分别较CK提高了3.13倍和2.58倍;而接种其他细菌的培养基,黑麦草根冠比与CK差异均不显著,其中,接种洋葱伯克霍尔德菌、苏云金芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的培养基,黑麦草根冠比分别较CK提高了1.09倍、0.77倍和1.69倍(表6)。表明类芽孢杆菌和巴氏芽孢杆菌显著影响了黑麦草的物质和能量分配,使其更倾向于地下根系的生长。
图6 不同细菌对黑麦草根冠比的影响Fig.6 Effects of different bacteria on R/C of L.perenne
植物与土壤微生物之间是相互联系的,作为生产者的植物为土壤微生物提供了碳源,而土壤微生物作为分解者,为植物生长提供养分[17]。由于微生物在分解有机质过程中,只有当自身的营养需求被满足时,才会提供植物体养分,所以植物与土壤微生物之间也存在对养分的竞争[18];同时,这些微生物也可以通过其生命活动进而影响植物的生长发育[19]。天津海底淤泥中具有十分丰富的微生物资源,这些微生物进入陆地系统后,对黑麦草种子萌发和植株生长势必会造成一定的影响。本研究分析了分离自天津吹填淤泥中的14株可培养细菌在其生命活动过程中,对黑麦草种子萌发和植株生长的影响。结果表明,丁香假单胞菌、海水芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌对黑麦草种子萌发和植株生长均表现出促进作用,黑麦草地上部和地下部鲜重均明显增加,而干重增加幅度均相对较低,说明黑麦草整体相对含水量增加。这可能是由于这4株菌株能够有效扩大黑麦草幼苗根系的吸收表面积,增强根系对水分的吸收和运输能力,从而促进了黑麦草整体的生长[20]。江绪文等[21]发现芽孢杆菌DY-3能够提高烟草幼苗的耐盐性,该菌即为本试验中所用的海水芽孢杆菌。Nadeem等[22]发现盐胁迫下接种丁香假单胞菌、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)能提高玉米叶片的相对含水量。本研究发现,特氏盐芽孢杆菌对黑麦草植株生长也有促进作用,但其对黑麦草地上部干重的影响较对地上部鲜重的影响更大,其具体作用机理仍需要进一步研究。
本研究发现,盐单胞菌、苏云金芽孢杆菌、西伯利亚微小杆菌、海洋芽孢杆菌对黑麦草种子萌发和植株生长并没有表现出明显的影响,这也可能是由于培养条件、细菌浓度的限制,或其对黑麦草的影响体现在其他方面等,原因仍需进一步试验求证。
本研究发现,洋葱伯克霍尔德菌、巴氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌对黑麦草种子萌发的影响差异并不显著,但均对黑麦草株高具有显著的抑制作用,且黑麦草叶片叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量也低于CK,而根冠比均呈现增加。黑麦草叶片叶绿素含量的降低意味着植株光合效率降低,光合积累的有机物含量也降低,因此株高受到显著抑制;黑麦草根冠比增加意味着物质和能量更倾向于地下分配。洋葱伯克霍尔德菌对黑麦草地上、地下生物量影响均较小,说明其对黑麦草水分和养分的吸收、运输无显著影响。解淀粉芽孢杆菌、类芽孢杆菌显著降低了黑麦草地上部生物量,且地上部鲜重降幅大于干重的变化幅度,说明黑麦草叶片含水量降低,对黑麦草水分吸收和代谢具有影响。这也可能是由于洋葱伯克霍尔德菌和解淀粉芽孢杆菌自身均具有广泛的抑制其他真菌与细菌的能力[23,24],从而通过影响其他微生物,间接影响了黑麦草的生长发育。
本研究结果表明,海水芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、简单芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌均能够提高黑麦草种子萌发率,并促进其植株生长,可以进一步研究这些菌株的作用机理,确定最适的菌液浓度,并进行大规模培养,再添加到吹填土中,作为绿化改良菌株进行开发利用。丁香假单胞菌和特氏盐芽孢杆菌对黑麦草种子萌发的影响较小,而对其株高、叶绿素含量和生物量均有促进作用,因此,这2种细菌具有研究价值,可以制作为菌剂肥料,待黑麦草生长到一定时期后施入。盐单胞菌、苏云金芽孢杆菌、西伯利亚微小杆菌和海洋芽孢杆菌对黑麦草种子萌发和植株生长的影响均较小。洋葱伯克霍尔德菌、巴氏芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和类芽孢杆菌对黑麦草植株生长则有抑制作用,这些细菌也是制约吹填区域绿化的障碍因子,在吹填区域绿化研究的过程中需要将其考虑在内。本研究结果可为进一步利用吹填淤泥微生物及其对吹填区域绿化进行改良,提供了新的研究方向和理论支持。
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Effects of the Bacteria Isolated from the M arine Sediment in Tianjin Port on Germ ination and Grow th of Lolium perenne
XU Shuai1,JIA Mei-qing2,MENG Yuan1,GOU Juan1,HUANG Jing1,ZHANG Guo-gang1*
(1.College of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China;2.Tianjin Normal University,Tianjin Key Laboratory of Water Resources and Environment,Tianjin 300387,China)
There are very rich microbial resources in the seafloor sediment of Tianjin Port.With the development and utilization of the sediment,those microorganisms have been entering the terrestrial ecosystems.14 strains culturable bacteria were used as detective materials in this study which have been isolated and identified,and Lolium perenne was chosen as representative lawn grass.In order to study the effect of these microbes on seed germination and growth of Lolium perenne.The results showed that Bacillus aquimaris,Bacillus megaterium,Bacillus simplex,Bacillus atrophaeus could promote Lolium perenne germination and growth obviously.While Pseudomonas syringae and Halobacillus trueperi have no effect on Lolium perenne germination but have a promoting effect on the growth.However,Halomonas campaniensis,Bacillus thuringiensis,Exiguobacterium sibiricum,Thalassobacillus devorans ha ve no effect on the germination and growth of Lolium perenne. Whereas Pseudomonas syringae,Bacillus butanolivorans,Bacillus amyloliquefaciens,Paenibacillus odorifer have a little impact on the germination,but have obvious inhibitory effect on the growth.This study could help us develop and utilize the microbes as an effective strategy to solve the barren in reclamation with pumping filling area.
Tianjin;Dredger sediments;Culturable bacteria;Lolium perenne;Seed germination;Growth and development
S543+.6
:A
:1008-1631(2017)02-0066-06
2016-10-09
天津市科技支撑重点项目(15ZCZDSF00410);天津市自然科学基金项目(12JCYBJC19700)
许帅(1992-),男,安徽亳州人,硕士研究生在读,研究方向为盐碱地生物改良。E-mail:xushuai19921003@ 163.com。
张国刚(1976-),男,黑龙江伊春人,副教授,博士,主要从事土壤生态学研究。E-mail:zangguogang@163.com。