基于PCR-RDB技术的膜芯片开发并应用于遗传性非综合征耳聋检测*

彭陆衡

(东莞市第八人民医院，广东 东莞 523325)

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基于PCR-RDB技术的膜芯片开发并应用于遗传性非综合征耳聋检测*

彭陆衡

(东莞市第八人民医院，广东 东莞 523325)

目的 研究基于PCR-RDB技术的膜芯片开发并应用于遗传性非综合征耳聋检测效果。方法 以2015年11月至2017年1月期间东莞市儿童医院1865例新生儿为研究对象，采集足跟血并提取基因组DNA。根据文献报道的中国人群常见耳聋易感基因的热点突变，选取4个基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和12S r RNA)20个突变位点，通过PCR-RDB方法，对新生儿体内4个基因之中9个高发突变位点相应基因片段进行PCR扩增，且于扩增产物两端作出生物素标记，同时在膜条上固定9个不同待检位点的突变阵列与正常探针阵列，将正常阵列作为对照，当扩增产物以及探针杂交后，通过显色反应与是否存在杂交信号判断基因突变情况。结果 检出耳聋基因突变携带新生儿62例，携带率为3.32%，其中杂合突变60例(3.22%)，复合杂合突变1例(0.05%)，纯合突变1例(0.05%)。在阳性检出样本中，GJB2及SLC26A4基因突变占总阳性突变的83.87%(56/62)。阳性突变位点最常见的是GJB2基因的235delC突变，共检出31例(50%，31/62)，其次是SLC26A4基因的IVS7-2A>G(19.35%，12/62)。本研究检出纯合突变样本中，1例为12S rRNA基因的1555A>G突变；235de1C杂合突变基因样本以及1VS7-2A>G杂合突变基本样本各位点显色具有均一性。结论 经临床研究验证，基于PCR-RDB技术的膜芯片可用于遗传性非综合征耳聋的检测,具有较高准确性与重复性。

PCR-RDB技术；膜芯片；开发；遗传性非综合征耳聋；检测

反向点杂交法(reverse dot blot，RDB)是一种成熟的基因检测方法，可同时用于检测样本中存在的多个基因改变，尤其在同时检测样本中存在的多个点突变方面具有很强的优势[1-2]。该方法改变了传统的点杂交程序，其检测过程明显缩短，操作也较简化。PCR-反向点杂交法是将多种探针同时预先固定于膜上，然后用扩增的靶 DNA 与之杂交。每个样品均只需扩增一次然后杂交一次即可，故既适用于少量标本的分型检测，也适用于大量标本的同时分型，无需特殊仪器设备。引物用生物素标记，对人体无害，杂交膜可一次性大量制备后备用。本研究以1865例新生儿作为研究对象，分析基于PCR-RDB技术的膜芯片对于遗传性非综合征耳聋的检测效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年11月至2017年1月期间东莞市儿童医院1865例新生儿为研究对象，取患者抗凝全血，引物与探针来自英潍捷基贸易有限公司，并由PALL公司提供尼龙膜，DNA提取试剂盒源于QIAGEN公司，并由ABI公司提供PCR仪。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取待检者全血200 μl，以EDTA进行抗凝处理，参照DNA提取试剂盒操作说明书完成DNA提取过程。

1.2.2 引物与探针设计 自Genebank数据库里面选出GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因及SLC26A4基因序列，通过DNAStar以及Oligo6.0设计5对引物，对常见的9个位点基因进行扩增。包括GJB2基因的35delG、176-191del16、235delC、299-300delAT四种突变；GJB3基因的538C>T突变；12S rRNA基因的1494C>T和1555A>G两种突变；SLC26A4基因的2168A>G和IVS7-2A>G突变。

1.2.3 开发膜芯片 将膜条置于浓度为5%EDC里面浸泡半小时后用水洗数次，且每次冲洗1～5 min，放在滤纸上晾干。采取0.1 M NaOH溶液将其浸泡2 min以上，取出水洗数次，并且每次1～5 min，最后自然风干膜条，将其裁剪之后保存备用。

1.2.4 PCR扩增 对设计好的5对引物予以多重PCR。采取正交试验法进行大量实验对比，选择最优反应体系。扩增过程中，需向每管反应液里面添2 μl模板。通过大量实验对比，获得如下最佳扩增程序：

1.2.5 杂交检测 设计9个位点的正常与突变探针共18条，与PCR产物进行杂交。 ①膜条制备：先用打印机在膜条上打印位点阵列；配制20 ml 5%的EDAC溶液泡膜30 min，然后纯水浸洗三次，每次2 min，晾干配制探针稀释液：2.1 g的NaHCO3溶于50 ml纯水将各探针稀释至5 μmol/L；将探针点加在膜条相应位点上，点膜前后用纯水清洗点膜枪15次；晾干膜条，用0.1 mol/L的NaOH泡膜5 min；纯水浸洗三次，每次2 min，晾干备用。②膜条杂交：膜条标上待检者编号，放入15 ml 塑料离心管中加入约8 ml的A液和两管PCR产物，盖上盖子放入沸水浴中加热10 min放入50 ℃杂交箱中杂交2 h以上，同时预热B液至50 ℃杂交完成后，将膜条移到B液中于50 ℃洗膜10 min(一管最多洗4张膜)配制孵育液(新鲜配制，比例为1 μl POD，2 ml A液)，参考量为每张膜条2 L POD膜条放入孵育液中室温轻摇孵育30 min，倒弃孵育液A液室温轻摇洗膜两次，每次5 min C液室温洗膜一次2 min配制显色液(新鲜配制，按顺序加入C液19 ml，TMB 1 ml，30% H2O22 μl)，放入膜条，避光静置浸泡10 min去离子水洗膜一次，即可观察结果。

1.3 判定标准 突变杂合子：突变探针处产生显色强度和野生型探针类似蓝色斑点；突变纯合子：产生蓝色斑点并且野生型探针位置无蓝色斑点；复合突变：杂合与纯合两种同时存在；未突变：只有野生型探针位置产生蓝色斑点[3]。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0软件处理，计数资料以(%)表示，并以χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 耳聋基因突变检出率 见表1。检出耳聋基因突变携带新生儿62例，携带率为3.32%，杂合突变占3.22%，复合杂合突变占0.05%，纯合突变占0.05%。

表1 耳聋基因突变检出率

2.2 耳聋易感基因筛查结果 见表2。在阳性检出样本中，GJB2及SLC26A4基因突变占总阳性突变的83.87%(56/62)。阳性突变位点最常见的是GJB2基因的235delC突变，共检出31例(50%，31/62)，其次是SLC26A4基因的IVS7-2A>G(19.35%，12/62)。纯合突变样本中，1例为12S rRNA基因的1555A>G突变。

2.3 重复性测定分析 选择235de1C杂合突变基因样本以及1VS7-2A>G杂合突变基本样本分别1例，并采取最低检测限浓度(10 ng/μl)，均检测10次，发现各位点显色具有均一性，说明重复性较高。

3 讨 论

耳聋属于人类感觉系统高发疾病，其中新生儿发生率高达l%～3%[4]。依据病因能够分为两种：遗传性耳聋与非遗传性耳聋，超过60%新生聋儿病因为遗传因素。

对于遗传性耳聋，其遗传异质性非常高，按照是否产生耳外组织异常以及病变，能分为两种：综合征性以及非综合征性。非综合性所占比例超过70%，已定位100个以上非综合性相关位点，并且克隆了68个不同致病基因[5]。其中包含有X连锁基因、常染色体隐性基因以及常染色体显性基因分别3个、40个与25个，各基因里面存在相应耳聋突变位点[6]。该类基因的克隆可以给破解听觉障碍带来可靠依据。

本组研究中，通过PCR-RDB方法，对1865例新生儿体内4个基因之中9个高发突变位点相应基因片段进行PCR扩增以及探针杂交。结果显示，检出耳聋基因突变携带新生儿62例，携带率为3.32%，杂合突变占3.22%，复合杂合突变占0.05%，纯合突变占0.05%，阳性检出样本中，GJB2及SLC26A4基因突变占总阳性突变比例最高。阳性突变位点最常见的是GJB2基因的235delC突变，，其次是SLC26A4基因的IVS7-2A>G，与柳红杰等[7]研究结论一致。说明基于PCR-RDB技术的膜芯片对遗传性非综合征耳聋具有较高检测准确性。结果还显示，235de1C杂合突变基因样本以及1VS7-2A>G杂合突变基本样本各位点显色具有均一性，与孙捷等[8]研究结论一致。说明基于PCR-RDB技术的膜芯片检测法重复性好。

[1] 李步荣,张彤,李丽华，等.PCR-RDB 技术在 HCV 基因分型中的应用研究[J].陕西医学杂志,2015,09(11):1551-1553.

[2] 肖奇志,周玉球,谢建红，等.基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析技术和反向点杂交技术应用于β-地中海贫血基因诊断与产前诊断的对比研究[J].中华检验医学杂志,2012,35(5):413-417.

[3] 李步荣,寻萌,段钊，等.应用 PC R-RDB 杂交技术检测人类乳头瘤病毒基因型的临床意义[J].检验医学与临床,2015,18(24):3684-3686.

[4] 唐向荣,严提珍,林墨菊，等.广西84例非综合征型聋患者遗传性聋基因芯片检测结果分析[J].听力学及言语疾病杂志,2014,22(4):344-347.

[5] 王莉,赵慧茹,廖世秀，等.非综合征性耳聋的基因突变分析和产前诊断[J].中华医学遗传学杂志,2013,30(5):518-521.

[6] 张初琴,陈波蓓,陈迎迎，等.不同年龄段非综合征性耳聋常见基因检测及临床表型分析[J].遗传,2013,35(3):352-358.

[7] 柳红杰,刘日明,丛江琳，等.育龄期夫妇非综合征性耳聋基因突变位点检测结果分析[J].中华生物医学工程杂志,2016,22(3):194-199.

[8] 孙捷,韦桂玲,陈俞，等.86例非综合征型耳聋患者耳聋基因芯片检测结果分析[J].中华耳科学杂志,2013,15(2):216-219.

彭陆衡(1969—)，男，湖南衡阳人，主管检验师，本科，主要从事临床检验方面工作。

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1004-7115(2017)08-0935-02

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.08.036

2017-05-11)