香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5.1增殖的影响*

2017-07-24 18:11李永格
中医研究 2017年5期
关键词:抑制率香菇多糖

李永格

(南阳医学高等专科学校基础医学部, 河南 南阳473000)

·实验研究·

香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5.1增殖的影响*

李永格

(南阳医学高等专科学校基础医学部, 河南 南阳473000)

目的:探讨香菇多糖对肝癌细胞Huh7.5.1增殖的影响及其机制。方法:采用MTT法检测6.25,12.5,25,50,100 mg/L香菇多糖分别作用肝癌细胞24,48,72 h后,肝癌细胞增殖抑制率变化;qRT-PCR检测100 mg/L香菇多糖处理肝癌细胞48 h后,微小RNA138(miR-138)表达变化。结果:细胞的增殖抑制率随香菇多糖质量分数的增高、作用时间的延长呈依赖性升高;相同作用时间,12.5,25,50,100 mg/L香菇多糖组的细胞增殖抑制率较6.25 mg/L组明显升高,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01);相同质量分数的香菇多糖组48 h、72 h的细胞增殖抑制率较同组内24 h明显升高,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01);100 mg/L香菇多糖作用48 h后肝癌细胞抑制率为(50.36±5.13)%,作为后续实验质量分数和作用时间。qRT-PCR检测发现,100 mg/L香菇多糖处理肝癌细胞48 h后,miR-138表达明显高于对照组,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:香菇多糖能够抑制肝癌细胞增殖,可能是通过提高肝癌细胞miR-138表达实现的。

香菇多糖/药效学;肝癌;微小RNA138;细胞增殖抑制率

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤,发病率逐年上升,在我国每年新发生的肝癌病例约占总数的一半,病死率在恶性肿瘤中居第二位[1]。肝癌起病隐匿,确诊时已到达疾病晚期或已经发生转移,治疗困难。中药在防治肝癌复发、转移,改善中晚期患者症状,延长生存期方面具有明显优势。香菇多糖(lentinan,LNT)为香菇子实体细胞壁的结构成分,具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗病毒等多种生物活性[2-3]。LNT已在肝癌治疗中发挥作用,但作用机制尚不清楚。本研究通过LNT体外作用于Huh7.5.1肝癌细胞,观察肝癌细胞增殖变化,qRT-PCR检测miR-138表达,从微小RNA(microRNAS,miRNAs)角度探讨LNT对肝癌作用机制,为LNT抗肝癌的作用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞系Huh7.5.1购自上海中科院细胞库,本课题组保存。

1.2 药品、试剂及仪器

香菇多糖为南阳医学高等专科学校国家中药分析实验室惠赠,批号1541023。四甲基偶氮唑盐(MTT),购自美国Sigma公司,批号1602013;100 mL/L 胎牛血清(1600123)、DMEM培养基(1600123),均为美国Invitrogen公司产品;RIPA裂解液,南京生兴生物技术有限公司产品,批号1605032;Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR quantitation Kit(批号1603215)、U6 snRNA Real time RT-PCR nomallization Kit(批号1603215),均为上海吉玛制药技术有限公司产品;其他试剂均为国产分析纯或化学纯。680酶联检测分析仪,美国伯乐公司产品;ABI7500荧光定量PCR仪,ABI公司产品。

1.3 细胞培养

将人肝癌细胞系Huh7.5.1培养在100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中,置于37 ℃、50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中常规培养。取生长良好并处于对数生长期的细胞用于实验。

1.4 检测指标

1.4.1 MTT法检测LNT对细胞增殖抑制率的影响

取处于对数生长期的肝癌细胞接种于96孔板中(2×103个/孔),细胞贴壁后,弃去培养液,分别用预先制备好的含不同质量分数(100,50,25,12.5,6.25 mg/L)LNT的安全培养液200 μL孵育,设为LNT组,每个质量分数设5个复孔。对照组加不含LNT的DMEM培养液200 μL。分别孵育24,48和72 h后,每孔加20 μL的MTT,继续培养4 h后,小心吸去上清后,加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)溶液,水平振荡10 min,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪中,以波长为490 nm测定每孔光密度(D值)。重复测定4次,计算细胞生长抑制率。抑制率(%)=(1-DLNT组/D对照组)×100%

1.4.2 qRT-PCR检测细胞miR-138表达量

根据1.4.1结果选取质量分数为100 mg/L LNT处理48 h肝癌细胞和对照组细胞,进行qRT-PCR实验。Trizol法提取肝癌细胞总RNA,参照试剂盒说明书合成cDNA,其具体反应体系为20 μL:2 μL总RNA,1.25 μL特异性茎环引物,0.5 μL逆转录酶(MMLV),0.5 μL RNA酶抑制剂,1 μL dNTP以及4 μL逆转录缓冲液,补DEPC水配成20 μL反应体系。充分混匀后按17 ℃ 30 min,45 ℃ 30 min,85 ℃ 10 min体系进行逆转录,逆转录结束后立即将cDNA产物快速置冰上冷却。以cDNA为模板,利用miR-138特异性引物和染料分子SYBR Green进行PCR扩增。其反应体系如下(20 μL):2 μL cDNA模版,10 μL SYBR Green反应缓冲液,1 μL正向引物(10 μmol/L),1 μL反向引物(10 μmol/L),6 μL ddH2O。反应条件如下:95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。以U6作为内参,所有检测结果均采用2-ΔCt的方法进行分析。反应中所使用引物序列设计如表1。

表1 miR-138以及内参U6引物序列

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 不同质量分数LNT对Huh7.5.1细胞增殖的影响

LNT对Huh7.5.1细胞增殖有明显抑制作用,且表现为量效、时间依赖性:在同一时间点,药物质量分数越高,细胞增殖抑制率越高;同一质量分数药物作用,时间越长,细胞增殖抑制率越高。相同作用时间,12.5,25,50,100 mg/L香菇多糖组的细胞增殖抑制率较6.25 mg/L组明显升高,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01);相同质量分数的香菇多糖组48 h、72 h的细胞增殖抑制率较同组内24 h明显升高,差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01);且100 mg/L LNT作用48 h后,细胞生长出现半抑制,故选择100 mg/L LNT作用48 h来进行后续研究。见表2。

组 别细胞增殖抑制率24h48h72h香菇多糖6.25mg·L-1组10.51±2.5620.36±2.12#27.36±2.31##香菇多糖12.5mg·L-1组14.53±3.62*26.12±2.13*#36.21±4.32*##香菇多糖25mg·L-1组19.52±4.36**32.13±4.32**#46.35±5.23**##香菇多糖50mg·L-1组26.03±3.02**40.12±5.01**#57.18±6.28**##香菇多糖100mg·L-1组35.08±5.01**50.36±5.13**#70.13±6.96**##

注:与同一时间点香菇多糖6.25 mg·L-1组对比,*P<0.05,**P<0.01;与同组内24 h作用时间对比,#P<0.05,##P<0.01。

2.2 LNT作用后miR-138表达量变化

100 mg/L LNT组Huh7.5.1细胞miR-138的相对表达量是对照组细胞(3.05±0.21)倍,显著高于对照组细胞(P<0.05)。提示:100 mg/L LNT可提高Huh7.5.1细胞miR-138表达。

3 讨 论

肝癌临床治疗以手术切除及肝脏移植为主要方法,但治疗效果并不理想,术后复发与转移是影响肝癌预后的重要因素,阻碍肝癌患者的长期生存,导致其5年生存率不足5%[4-5]。LNT为香菇的子实体中提取的一组多糖成分,在肝癌治疗中已经得到认可。实验研究[6-8]表明LNT对肝癌细胞增殖有抑制作用,其机制集中在免疫调节和诱导肿瘤细胞凋亡;临床研究[9-10]也表明LNT联合5-Fu,LNT配合肝动脉化疗塞仃都能明显提高肝癌治疗疗效。本实验通过MTT法检测肝癌细胞增殖,发现不同质量分数LNT对Huh7.5.1细胞增殖有明显抑制作用,且表现为量效、时间依赖性,与其他学者研究结果相符。

miRNAs为一种内源性非编码单链RNA,研究发现其与肝癌密切相关[11]。近年研究[12]表明miRNAs广泛参与中药抗肿瘤作用,因此本实验选择从miRNAs角度探讨LNT对肝癌作用机制。miR-138是近年来新发现的一类具有肿瘤抑制作用的miRNA,可通过靶向多个癌基因抑制肿瘤生长,如miR-138能够靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭抑制[13];也能通过抑制靶基因hTERT蛋白的表达来抑制人胃腺癌细胞SGC-7901增殖能力[14];这些结果表明,miR-138是一种重要抑癌miRNA。研究发现miR-138在肝癌患者肿瘤组织中表达水平下调[15],且Huang[16]和Wang[17]等发现miR-138可通过靶向作用于cyclin D3诱导肝癌细胞周期阻滞,进而影响肝癌细胞生物学行为和临床肝癌患者预后。说明miR-138在肝癌中也同样可以发挥抑癌基因的作用。本实验通过qRT-PCR检测发现LNT组肝癌细胞miR-138表达明显高于对照组(P<0.05),表明LNT可上调肝癌细胞miR-138表达,抑制细胞增殖。

综上所述,香菇多糖能抑制肝癌细胞增殖作用,其机制可能是提高了肝癌细胞miR-138的表达。此为LNT治疗肝癌提供了新思路。

[1]SOERJOMATARAM I,LORTET-TIEULENT J,PARKIN DM,et al.Global burden of cancer in 2008:a systematic analysis of disability-adjusted life- years in 12 world regions[J].Lancet,2012,380(9856):1840-50.

[2]ZHANG YY,LI S,WANG XH,et al.Advances in lentian:isolation,struct-ure,chain conformation and bioactivities[J].Food hydrocolloid,2011,25(2):196-206.

[3]陈福禄,谢宝贵,郑金贵.药用菌多糖的药用功能与展望[J].中国药学杂志,2005,39(4):244-248.

[4]FONSECA AL,CHA CH.Hepatocellular carcinoma:a comprehensive overview of surgical therapy[J].J Surg Oncol,2014,110(6):712-9.

[5]SONG MJ,BAE SH.Newer treatments for advanced hepatocellular carcinoma[J].Korean J Intern Med,2014,29(2):149-155.

[6]桂明杰,亢学平,王鑫,等.香菇多糖对HepG2及H22肿瘤细胞的抑制研究[J].食用菌,2015,37(5):63-65.

[7]游如旭,张玉,汪柳,等.香菇多糖诱导鼠肝癌H22细胞凋亡机制的初步探讨[J].中国医院药学杂志,2015,35(9):776-781.

[8]姚庆兰.香菇多糖对原发性肝癌TACE前后外周血CD4+、CD5+调节性T细胞的影响[J].中国实用医药,2012,7(23):21-22.

[9]韩玲.香菇多糖的临床应用进展[J].中国新药杂志,2001,10(2):89-92.

[10]赵小茜,谭艳蓉,王萍,等.香菇多糖配合TACE治疗中晚期肝癌临床效果观察[J].山东医药,2005,45(32):37-38.

[11]张春艳,张富春,马纪,等.microRNA于肝癌[J].基础医学与临床,2016,36(10):1429-1432.

[12]吴唐维,宁勇,陈卫群.微RNA参与中药抗肿瘤作用的研究进展[J].重庆医学,2013,42(13):1536-1538.

[13]英舟,万义增,陈素贤. miR-138靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭[J].肿瘤防治研究,2016,43(5):340-344.

[14]陈陵,梁光萍,邹利全,等.miR-138对人胃腺癌细胞SGC-7901增殖的影响[J].中国肿瘤临床,2011,38(13):755-758.

[15]WANG W,ZHAO LJ,TAN YX,et al.Identification of deregulated miRNAs and their targets in hepatitis B virus-associatedhepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(38): 5442-5453.

[16]HUANG B,LI H,HUANG L,et al.Clinical significance of microRNA 138 and cyclin D3 in hepatocellular carcinoma[J].J Surg Res,2015,193(2):718-723.

[17]WANG W,ZHAO LJ,TAN YX,et al.miR-138 induces cell cycle arrest by targeting cyclin D3 in hepatocellular carcinoma[J] .Carcinogenesis,2012,33(5):1113-20.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2017)05-0072-03

R735.7

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.05.31

河南省高等学校重点科研项目计划(13B310176);南阳市科技攻关项目(2015KJGG020)

2017-03-14;

2017-05-03

猜你喜欢
抑制率香菇多糖
Modeling and Verification of a Sentiment Analysis System Using Aspect-Oriented Petri Nets
双酶水解鱼鳞蛋白制备ACE抑制肽的工艺优化研究
血栓弹力图评估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板药物的疗效
菠萝蜜多糖可调节肠道微生物
蔬菜使用不同处理方式对农药残留影响的研究
香菇接种三招
基于陇药黄芪多糖的提取与修饰研究
如何翻译“香菇油菜”?
小香菇的奇遇
沙蒿多糖乳化特性研究