菲牛蛭的含量测定方法改进及检测中的注意事项

张利

摘要：改进菲牛蛭的水蛭素含量测定方法及总结检测中的注意事项，提高方法的重复性及准确度，更有效地控制菲牛蛭的质量。

关键词：菲牛蛭；水蛭素；含量测定

中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）03—0071-03

菲牛蛭为医蛭科动物（Poecilobdella manillensis），俗称金边蚂蟥，别名马尼拟医蛭，是吸血类水蛭中个体较大的品种。其抗凝活性成分主要为水蛭素，其抗凝活性、抗血栓作用明显高于非吸血类水蛭，在治疗人类的心血管疾病，尤其是血栓性疾病具巨大的优越性，中国药典2015年版收载的药用品种为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra，Whitman、水蛭Hi-nude nipponica，Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acran ulata，Whitman的干燥体，与菲牛蛭动物品种来源不完全一致。云南省于2013年将菲牛蛭收录到《云南省中药材标准》中。考虑到简单易行，中国药典2015版水蛭质量标准及云南省的菲牛蛭质量标准对其水蛭素的含量测定均参照1970年Markwardt报道的凝血酶滴定法制定，其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1：1，而凝血酶已有国际单位NIH，水蛭素的活性以抗凝血酶活力单位ATU表示，一个ATU等于中和一个NIH凝血酶的水蛭素量，但此法受试剂及人为因素影响较大，重复性及准确度不够理想，有报道通过配制不同浓度梯度的凝血酶溶液，多次换试管重滴的浓度梯度法，重复性及准确度较好，但操作繁琐，耗时，不易掌握。笔者对菲牛蛭水蛭素含量方法进行一定的改进并提示检测过程中应注意的事项，以提高检测的重复性及准确度。

1仪器与试药

超级恒温水浴槽（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；DELTA320酸度计（梅特勒一托利多公司）；菲牛蛭（批号150601、150607、150706），云南海瑞迪生物药业有限公司；牛纤维蛋白原（批号140626-201310），牛凝血酶（批号140625-201009），中国食品药品检定研究院；水为纯化水；其他试剂为分析纯。

2方法与结果

2.1原方法测定水蛭素含量

2.1.1供试液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液15 mL，充分搅拌，浸提30 min，并时时振摇，过滤，取续滤液为供试品溶液。2.1.2缓冲液的配制取0.2 mol·L^-1三羟甲基氨基甲烷溶液25 mL与0.1 mol·L^-1盐酸溶液约40 mL，加水至100 mL，调节pH值至7.4。

2.1.3凝血酶滴定液的配制 取凝血酶标准品适量，加生理鹽水制成每1 mL含凝血酶40个单位的溶液（临用配制）。

2.1.4含量测定 精密量取续滤液100μL，置试管（8 mm×38 mm）中，加入含0.5%（牛）纤维蛋白原（以凝固物计）的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（临用配制）200μL。摇匀，置水浴中（37±0.5）℃保温5 min，滴加每1 mL中含40单位的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次2μL，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗的体积，按下式计算。

U=C₁V₁/C₂V₂

式中u为每1 g含凝血酶活性单位（U·g^-1）；C₂为凝血酶溶液的浓度（U·mL^-1）；C₂为供试品溶液的浓度（g·mL^-1）；V₁为消耗凝血酶溶液的体积（μL）；V₂为供试品溶液的加入量（μL）

中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位，本品每1 g含抗凝血酶活性应不低于60U。

2.2含量测定方法改进

2.2.1滴定终点的确定 滴定过程中以观察到试管内出现凝固物为滴定终点，故受外界及人为因素影响较大。而原方法固定为每分钟滴加2μL凝血酶溶液，活性规定为不低于60 U·g^-1，根据活性的计算公式1μL即可有约12 u·g^-1的差异。在测定中发现有时临近终点有时只需再滴加1μL就发生凝固。另外观察到滴定过程时间过长、摇动过频（超过15 min），不易观察到凝固，10 min内结束滴定方法的重复性较好。改进滴定过程为：先滴加凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次5μL～2μL边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗的体积；新取试管1只，重新测定（根据初测时消耗的体积，调整每分钟凝血酶的加入量，每次5μL-2μL），但在至近凝固时，改成每1 min滴加1次，每次1μL，滴定过程应在10 min内完成，记录凝固时消耗凝血酶溶液的体积，以后一次消耗的凝血酶体积计算含量。

2.2.2提取方式考察 同一批样品分别采用超声15 min、30 min，振摇30 min、60 min 4种提取方式，结果提取结果一致，为方便易行采用振摇30 min提取。采用0.9%生理盐水为提取溶剂，分别在室温（约20℃）、37℃、50℃、70℃下30 min振摇提取，结果显示，50℃、70℃下温度下水蛭素的活性明显下降。其他条件活性结果一致。故可保留原标准提取方式。

2.2.3滴定温度 温度对滴定过程影响大，同一批样品分别在25℃、37℃、50℃、70℃滴定，在25℃、37℃温度下滴定结果基本一致，后50℃、70℃温度下活性下降了30%以上，故原标准滴定温度可行。

2.2.4供试液pH对含量测定结果的影响 配制同批供试液10份，并用1.0 mol·L^-1NaOH或1.0 mol·L^-1HCL分别调节pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5按

2.2.1项的滴定方法进行含量测定，结果表明供试液pH值4.5～7.0间，其抗凝活性基本稳定（见表1），供试液pH值低于4.0时，溶液不澄清，无法观察凝固现象，pH值太高则抗凝活性降低。用生理盐水溶解后的供试品溶液pH值均在4.5-7.0之间。故供试液测定时无需调节pH值。

2.3结果 取3批样品，按菲牛蛭质量标准与改进后方法分别进行活性测定。3批结果见表2。

3讨论

改进每分钟滴入固定量的凝血酶溶液的原活性测定方法，而根据初测预估消耗凝血酶溶液的体积，再换管重测，临近终点时降低凝血酶溶液的滴入量，并限定滴定时间，可提高方法的重复性及准确度。

纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液霉变会影响凝固物观察，故都应临用新配。样品溶液、纤维蛋白原及凝血酶溶液均应澄清，否则会造成滴定终点提前。

每次的应轻微摇动，否则易造成原来凝固物分散。观察是否出现凝固时不应将试管拿出水面，整个滴定过程都应在37℃水浴中进行。

水蛭素的活性单位是根据中和凝血酶单位的量来确定，凝血酶保存不当效价会降低，故凝血酶标准品应按要求妥善保存，必要时候应重测其效价，以保证结果样品含量测定的准确性。

（收稿日期：2016-11-01）