自噬相关基因Beclin 1和微管相关蛋白轻链3在胃癌组织中的表达及临床意义

宋华勇 马 磊

(河南大学第一附属医院肿瘤科，河南 开封 475000)

自噬相关基因Beclin 1和微管相关蛋白轻链3在胃癌组织中的表达及临床意义

宋华勇 马 磊

(河南大学第一附属医院肿瘤科，河南 开封 475000)

目的 探究Beclin-1及LC3蛋白在胃癌组织中的表达水平，并分析其临床病理意义。方法 选取2015年3月—2016年3月我院收治的患者146例，收集其胃癌组织标本及癌旁组织标本，并采集146例健康黏膜组织作为对照组，利用SP方法检测Beclin-1和LC3的表达，并分析其表达与临床病理特征的关系。结果 Beclin-1及LC3在健康黏膜组织的表达最高，在胃癌组织中的表达最低，此外，上述两组蛋白在不同的性别、年龄及发病部位无明显差异，但在T3～T4分期、高、中分化程度及有淋巴结转移的胃癌组织中表达率显著降低。结论 胃癌组织中的Beclin-1及LC3蛋白的表达量显著低于正常组织及癌旁组织，提示与胃癌的发生及发展密切相关，本研究为胃癌的诊断、预防及治疗提供了新的思路。

自噬基因；Beclin-1；LC3；胃癌

胃癌危害性大，致死率高，成为威胁人类生命安全的主要疾病之一[1-2]。近年来，自噬系统对癌组织的治疗成为临床治疗中较受关注的一种方法，本研究通过免疫组织化法对胃癌患者癌组织及癌旁组织的自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达进行检测，评价其与胃癌临床特征的关系，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年3月—2016年3月我院收治的患者146例，经过影像检测手段、内镜活检及组织切片，确诊为胃癌患者，且上述患者均为首次诊断出胃癌，在此前并未进行放疗及化疗等治疗，本次研究取得了患者本人的同意及我院伦理委员会的批准。上述患者中，男81例，女65例，年龄31～71岁，平均(53.78±7.21)岁，按照国际抗癌联盟(UICC)的2009年第7版TNM临床分期法[3]：T1～T2期为83例，T3～T4期为63例。病理分期：低分级组织标本79例，高分级标本67例。此外，有76例胃癌组织标本发现淋巴结转移。同时选取正常胃黏膜标本146例作为对照组。两组标本患者在年龄和性别方面无明显差别，P>0.05。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器与试剂 XOSC数显恒温水浴锅(南京先欧仪器制造有限公司)、奥林巴斯BX40光学显微镜。S-P免疫组织试剂盒购自上海跃进医疗有限公司；兔抗人Beclin-1和LC3多克隆抗体由美国CST中国分公司提供。

1.2.2 检测方法 ①石蜡标本制作：1.1中胃癌组织、癌旁组织及健康胃黏膜组织的标本手术切下后立即放入10%福尔马林中浸泡24 h，之后分别用70%～100%乙醇(2 h)梯度脱水处理，处理后的标本用二甲苯(PX)进行透明处理2 h；最后除杂质后，放入纯石蜡中，4 ℃保存待用。②制片：将①中的石蜡切成厚度为4 μm切片，放置于载玻片上滴1 ml蒸馏水，在恒温水浴锅上烘干。③组织切片在PX中浸泡10 min，依次用无水乙醇—95%乙醇—70%乙醇分别浸泡5 min脱水后，磷酸盐漂洗3次，每次3 min。④切片放入柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复处理，随后PBS冲洗5 min×3，将过氧化氢的甲醇溶液滴在标本上，20～25 ℃下静置12 min，抑制内源性过氧化物酶活性，消除误差的影响；④PBS液洗5 min×3后做封闭处理，室温孵育0.5 h。⑤加入适量兔抗人Beclin-1和LC3多克隆抗体，在4℃下过夜，次日PBS洗3次各5 min。⑥加入相应的二抗后静置10～15 min，PBS洗5 min×3。⑦DAB显色：在组织标本上滴加DBA显色剂并在显微镜下观察染色程度，PBS冲洗10 min；⑧苏木精复燃4 min后用不同浓度酒精脱水后冲洗10 min；⑨PX处理后，BX40光学显微镜下观察；⑩PBS取代一抗制备的阴性对照。

1.3 观察指标 为确保实验的准确度与可靠性，本实验制备的切片由我院两位资深的病理医师证实诊断。观察Beclin-1及LC3在细胞内的分布情况，细胞质出现黄染，为阳性(+)，根据阳性细胞染色程度及着色细胞百分率进行计分，两分值相加，0～2为阴性(-)，2～3为阳性(++)，4～6为强阳性(+++)[4]。

1.4 统计学方法 数据统计采用SPSS19.0来完成，采用χ2检验比较Beclin-1及LC3在胃癌组织及正常组织中的表达，并分析其表达与胃癌病理特征之间的关系，P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Beclin-1及LC3在胃癌组织中的表达 见表1。

表1 Beclin-1及LC3在胃癌组织中的表达[n(%)]

注：与健康胃粘膜组织比较，#P<0.05；与癌旁组织比较，*P<0.05。

2.2 Beclin-1及LC3与胃癌临床特征间的相关性分析 见表2。

表2 Beclin-1及LC3与胃癌临床特征间的相关性

3 讨 论

随着近年来人们生活压力的增大及饮食不规律等，胃癌的发病率呈逐年升高的趋势，成为临床上消化道的主要恶性肿瘤[5-7]，胃癌早期患者多通过手术切除癌变部位，抑制癌细胞扩散，从而起到治疗的作用。但是目前多数患者在临床确诊时已为晚期，手术切除难度大，多采用化疗等治疗手段，效果不佳，对患者的生活及生命安全带来巨大威胁，生理上造成极大痛苦。随着生物技术的发展，自噬基因对癌症的诊断及治疗越来越受到关注。

自噬是机体维持细胞内稳态的重要机制，自噬基因的损伤或丢失造成机体内环境紊乱，促进肿瘤的发生与发展。Beclin-1是一种自噬的调控因子，该因子可以通过调节细胞增长，清除诱导细胞非正常凋亡的细胞及组织，抑制肿瘤的扩散[8-10]。本次研究探究Beclin在胃癌组织中表达时发现，Beclin-1在胃癌组织、癌旁组织及健康组织中的表达率分别为39.73% (58/146)、72.60%(106/146)、94.52%(138/146)，三者之间存在显著差异。

LC3是自噬系统中不可缺少的蛋白，其表达量与自噬作用息息相关[11]，本次研究结果显示：LC3的阳性率分别为43.15%(63/146)、77.40%(113/146)及93.15(136/146)，在胃癌组织中的表达率明显低于癌旁组织及健康组织。在分析Beclin-1及LC3表达与临床特征关系时发现，在年龄、性别及胃癌癌变部位等方面，两种蛋白的表达无显著性差异，但Beclin-1在病理分期T3～T4、高分化癌组织及有淋巴结转移的组织中阳性表达率分别为17.46%(11/63)、11.94%(8/67)、17.79%(12/76)，显著低于T1～T2分期、低分化程度及无淋巴结转移的组织；另外LC3在病理分期T3～T4、高分化癌组织及有淋巴结转移的组织中阳性表达率分别14.29%(9/63)、13.40%(9/67)、13.16%(10/76)，上述结果说明，Beclin-1及LC3的表达率与肿瘤的分期、分化及淋巴结转移密切相关，该结果与罗小月文献中的结果一致[12]。

综上所述，胃癌组织中Beclin-1及LC3蛋白的表达量显著低于正常组织及癌旁组织，提示与胃癌的发生及发展密切相关，随着生物技术的进一步发展，Beclin-1及LC3在胃癌中的作用机制进一步明确，该生物标志物将对胃癌的诊断、治疗及预后具有重要的临床价值。

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Expression of autophagy related gene Beclin 1 and microtubule associatedprotein light chain 3 in gastric carcinoma and its clinical significance

SONG Hua-yong MA Lei

(Dept. of Oncology, The First Affiliated Hospital of Henan University,Kaifeng 475000, China)

Objective: To explore the expression of Beclin-1 and LC3 protein in gastric carcinoma tissues, and to analyze its clinical pathological significance. Methods: 146 patients were selected from March 2015 to March 2016 in our hospital, the gastric cancer tissues and paracancerous tissues were collected, and healthy mucosal tissues of 146 cases were collected as the control group, SP method was used in the detection of Beclin-1 and LC3, and the relationship between their expression and clinical pathological features was analyzed. Results: the highest expression of Beclin-1 and LC3 were in healthy tissues, and the lowest expression was in gastric carcinoma tissues, proteins in different gender, age and disease sites had no obvious difference between the two groups, but in the T3～T4 stage, high degree of differentiation and lymph node metastasis in gastric cancer tissue expression rate decreased significantly. Conclusion: The expressions of Beclin-1 in gastric cancer and LC3 protein is significantly lower than that of normal tissue and cancer tissue, suggesting that they are closely related with the occurrence and development of gastric cancer, and the study for the diagnosis of gastric cancer provides new ideas for prevention and treatment.

autophagy gene; Beclin-1; LC3; gastric cancer

宋华勇(1974—)，男，河南驻马店人，本科，主治医师，从事肿瘤内科工作。

R735.2

A

1004-7115(2017)07-0731-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.07.004

2017-04-08)