混合发酵法制备韭籽粕水溶性膳食纤维

孙婕，尹国友，王超，王琦，李文建，张现青

（1.河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山467036；2.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036；3.加拿大农业与食品部圭尔夫研究与发展中心，加拿大安大略圭尔夫N1G5C9）

混合发酵法制备韭籽粕水溶性膳食纤维

孙婕1，尹国友1，王超2，王琦3，李文建1，张现青1

（1.河南城建学院生命科学与工程学院，河南平顶山467036；2.杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州310036；3.加拿大农业与食品部圭尔夫研究与发展中心，加拿大安大略圭尔夫N1G5C9）

采用混合发酵法，从韭籽粕中制备水溶性膳食纤维。通过单因素试验确定料液比、发酵时间、混合菌体积比例和接种量的最适水平，再通过L9（34）正交试验确定最佳工艺条件。混合发酵法制备韭籽粕水溶性膳食纤维的最佳工艺为：料液比为1∶20（g/mL），发酵时间72 h，混合菌体积比例2∶1，接种量为10%，水溶性膳食纤维的得率达到33.28%。通过混合发酵法制备的水溶性膳食纤维溶胀度和持水力分别达到11.52 mL/g和7.32 g/g，符合高品质膳食纤维的要求。

水溶性膳食纤维；混合发酵法；韭籽粕；得率

韭菜籽是韭菜干燥成熟的种子，又名韭菜子、韭子[1]。同时它也是传统中药的重要组分之一，始载于《名医别录》，列为中品，具有很高的营养价值和药用价值。文献中记载其有“温肾助阳”的作用[2]，研究韭菜籽中生物活性成分的功能作用研究意义重大。

膳食纤维分为水溶性膳食纤维SDF和水不溶性膳食纤维IDF两类。水溶性膳食纤维主要是指不被人体消化道酶消化，但可溶于温、热水且其水溶液又能被其4倍体积的乙醇再沉淀的部分[3]。水溶性膳食纤维与水不溶性膳食纤维相比，具有特殊的生理活性，能在结肠中几乎被彻底水解产生更多的短链脂肪酸，因而对结肠癌的防治效果更好[4]，在清除机体的有害物质和降低血清胆固醇等方面有效果较好[5]，因此水溶性膳食纤维在医学界和食品界受到广泛关注[6]。本文采用微生物混合发酵制备韭籽粕中水溶性膳食纤维，旨在获取高品质的水溶性膳食纤维，以其为韭菜籽的综合利用等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

韭籽粕：平顶山市农业科学院；牛肉膏、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂：天津市致远化学试剂有限公司；无水乙醇：洛阳市化学试剂厂。

黑曲霉（40970）：中国工业微生物菌种保藏管理中心；枯草芽孢杆菌：河南城建学院生命科学与工程学院实验室保藏。

FA1004B电子天平、PHSJ-3F型pH计：上海精密科学仪器有限公司；KDC-1044底速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；CXC-06粗纤维测定仪：上海新嘉电子有限公司；DL-1万用电炉：北京中兴伟业仪器有限公司；数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；HZQ-C空气浴振荡器：哈尔滨市东明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 试验流程

韭籽粕→粉碎过筛→配制发酵培养基→121℃灭菌30 min→接入菌种→发酵→灭菌→离心分离→上清液→4倍体积乙醇醇沉→离心分离→干燥→SDF

1.2.2 韭籽粕的预处理

韭籽粕粉碎过60目筛，密封备用。

1.2.3 黑曲霉的活化及扩大培养

参考练杰[7]方法，略有修改。配置CM0015察式琼脂培养基，接种后于28℃培养箱培养5 d～7 d，然后继续进行传代培养，2代～3代后恢复活力。然后，将恢复活力后的斜面培养的黑曲霉，加入生理盐水制成106个/mL单胞子悬液，然后接种到100 mL不含琼脂的察式种子培养基中，振荡培养3 d，待生成均一小菌丝球时用于发酵。取出置于4℃冰箱备用。

1.2.4 枯草芽孢杆菌的活化及扩大培养

将实验室保藏的枯草芽孢杆菌试管斜面进行活化，接种于实验室常用的牛肉膏蛋白胨培养基，在37℃培养箱中培养24 h。然后加入生理盐水制成106个/mL菌悬液，然后接种到100 mL不含琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃震荡培养24 h后用于发酵。取出置于4℃冰箱备用。

1.2.5 混合发酵法制备韭籽粕水溶性膳食纤维单因素试验

影响黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合发酵制备韭籽粕膳食纤维的主要因素有料液比、发酵时间、混合菌体积比例和接种量[4，8-9]。需要通过试验明确各个因素对提取效果的影响程度。发酵液初始pH值以及发酵温度分别设置为7.0和30℃。

1.2.5.1 料液比对SDF得率的影响

称取韭籽粕3.0 g，发酵时间为48 h、接种量为10%、混合菌体积比例为 1∶3，分别选取 1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）为不同的料液比进行试验，发酵结束后加入4倍体积95%乙醇后静置过夜，离心烘干沉淀计算SDF得率，从而确定最适料液比。

1.2.5.2 发酵时间对SDF得率的影响

称取韭籽粕3.0 g，接种量为10%、混合菌体积比例为 1 ∶3、料液比为 1 ∶15（g/mL），分别选取 24、36、48、60、72 h为不同的发酵时间进行试验，发酵结束后加入4倍体积95%乙醇后静置过夜，离心烘干沉淀计算SDF得率，从而确定最适发酵时间。

1.2.5.3 混合菌体积比例对SDF得率的影响

称取处理过的韭籽粕3.0 g，设定发酵液初始pH值为7.0、发酵温度为30℃、发酵时间为24 h、接种量为10%、料液比为1∶20（g/mL），分别选取黑曲霉和枯草芽孢杆菌体积比为 1∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3∶1 为不同的混合菌比例进行试验，发酵结束后加入4倍体积95%乙醇后静置过夜，离心烘干沉淀计算SDF得率，从而确定最适混合菌体积比例。

1.2.5.4 接种量对SDF得率的影响

称取处理过的韭籽粕3.0 g，发酵时间为24 h、料液比为 1 ∶20（g/mL）、混合菌体积比例为 1 ∶3，分别选取6%、8%、10%、12%、14%为不同的接种量进行试验，发酵结束后加入4倍体积95%乙醇后静置过夜，离心烘干沉淀计算SDF得率，从而确定最适接种量。

1.2.6 正交试验设计

根据单因素试验结果，分析各个因素对SDF含量的影响程度，确定正交试验各个因素水平，设计L9（34）正交试验，正交试验因素水平见表1。

表1L9（34）正交试验因素水平Table 1L9（34）factors and levels of orthogonal test

根据正交试验结果，对数据进行正交分析，确定各因素对SDF含量的影响程度的大小，从而得到最佳发酵工艺条件。

1.3 SDF理化特性的测定[10-11]

1.3.1 膨胀力的测定

准确称取1.000 g制得的SDF样品于25 mL量筒中，记录质量m（g）和体积V1（mL），准确加入蒸馏水10 mL，用磁力搅拌器使SDF分散均匀，置于25℃的水浴锅恒温，在第24小时记录充分溶胀后的物料的体积V2（mL），获得最终溶胀度。膨胀力=（V2-V1）/m。

1.3.2 持水力的测定

准确称取制得的SDF样品1.000g（m0）置于100mL烧杯中，加蒸馏水40 mL，磁力搅拌器使SDF溶液分散均匀，24 h后，转移至离心管中，在3 500 r/min的速度下离心30 min，倾去上清液，擦干管壁附着的水分，称其质量m1（g），并计算出每克SDF样品的持水力（WCH）。WCH/（g/g）=（m1-m0）/m0。

2 结果与分析

2.1 韭籽可溶性膳食纤维提取条件的确定

2.1.1 料液比的确定

料液比对SDF得率的影响结果见图1。

图1 料液比对SDF得率的影响Fig.1 Effects of ratios of material and liquid on the yield of SDF

由图1可知，随着料液比的增加，SDF的得率呈现先增长后下降的趋势，在料液比为1∶15（g/mL）时，SDF得率达到最大。之后韭籽SDF得率呈现下降趋势。发酵液中水分过多或者过少都不利于枯草芽孢杆菌和黑曲霉在发酵培养基中的生长，从而影响到SDF的得率[10]。因此，选择1∶15（g/mL）为最佳料液比。

2.1.2 发酵时间的确定

发酵时间对SDF得率的影响结果见图2。

由图2可以看出，随着发酵时间的延长，最初SDF得率呈现增长的趋势，在60 h时SDF得率达到最大为27.04%。而后则出现下降趋势，其可能原因是发酵开始时菌体自身生长，SDF也不断积累，60 h达到最大，然而随着时间的延长发酵液pH值发生变化，抑制了自身菌体的生长，从而使发酵产生的可溶性膳食纤维量减少[12]。结合实际情况考虑，选择60 h为最佳发酵时间。

2.1.3 混合菌体积比例的确定

混合菌体积比例对SDF得率的影响结果见图3。

图2 发酵时间对SDF得率的影响Fig.2 Effects of fermentation time on the yield of SDF

图3 混合菌体积比例对SDF的影响Fig.3 Effects of the proportion of mixed bacteria on yield of SDF

由图3可知，随着混合菌体积比例的变化，SD得率出现先增长在降低的趋势。随着黑曲霉比例的降低，SDF含量出现增长，在混合菌体积比为1∶1时，SDF得率最高为30.74%。其可能原因是当两种菌的体积比为1∶1时，发酵液中营养物质恰好适合两种菌的生长，所以SDF得率较高；而当为其它接种比例时，两种菌之间可能存在营养竞争关系，因而发酵效果较差[12]。因此，选择混合菌体积比例1∶1为最佳比例。

2.1.4 接种量的确定

接种量对SDF得率的影响结果见图4。

图4 接种量对SDF得率的影响Fig.4 Effects of the inoculum on the yield of SDF

由图4可知，随着接种量的增多，SDF得率先升高，在接种量为8%时，SDF得率最高达到30.24%。之后，随着接种量的增加，SDF得率逐渐下降。其可能原因是在有限的营养中，随着接种量的增大，营养供应不上菌体的生长，即接种量过大会导致前期发酵剧烈，后期发酵不足，因而SDF得率降低[4]。因此，8%接种量比较合适。

2.2 韭籽粕水溶性膳食纤维提取条件优化

四因素三水平正交表试验结果如表2所示。

表2L9（34）正交试验结果Table 2Results of L9（34）orthogonal test

由表2可以看出，韭籽水溶性膳食纤维SDF的最佳发酵工艺条件为 A3B3C1D3，即料液比为 1∶20（g/mL），发酵时间为72 h，混合菌比例为2∶1，接种量为10%。由极差分析可知，各因素作用的主次顺序为B＞A＞C＞D，即发酵时间＞料液比＞混合菌体积比例＞接种量。方差分析见表3。

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal combination experiment

由方差分析表3可以看出，FA=103.274＞F0.01（2，4）=99，FB=205.720＞F0.01（2，4）=99，说明发酵时间和料液比对水溶性膳食纤维SDF得率影响差异极显著，即发酵时间和料液比对试验结果影响极显著。FC=24＞F0.05=19，认为因素C即混合菌体积比例对水溶性膳食纤维SDF得率影响差异显著。而FD=1.000＜F0.05=19，认为因素D对水溶性膳食纤维SDF得率无显著影响。从各个因素的F值大小可看出，各因素对SDF的得率影响的主次顺序：发酵时间＞料液比＞混合菌体积比例＞接种量，最优水平组合为A3B3C1D3，这与用极差的判断结果一致。由于表3中没有A3B3C1D3，因此需要对得到的最佳水平进行验证试验。验证试验结果表明，在此最佳工艺条件下SDF得率达到33.28%，均优于正交表中所有组合，确定其为最佳的发酵条件，即料液比为1∶20（g/mL），发酵时间为 72 h，混合菌体积比例为 2∶1，接种量为10%。

2.3 韭籽SDF理化特性测定

2.3.1 膨胀力的测定结果

膨胀力/吸水性是指产品吸附或摄取水分的能力。通常用每克产品吸附水分的克数或毫升数来表示。本试验测得的SDF的膨胀力为11.52 mL/g。

2.3.2 持水力的测定

由试验可得持水力7.32 g/g，韭籽SDF的持水力比较高。

3 结论

由试验结果可知，混合发酵法制备韭籽粕水溶性膳食纤维SDF的最佳发酵工艺为：料液比为1∶20（g/mL），发酵时间为72 h，混合菌体积比例为2∶1，接种量为10%。在此工艺条件下，水溶性膳食纤维得率达到33.28%。高品质膳食纤维它的溶胀性应大于10 mL/g，持水力不小于7 g/g[13]，而本试验制备的水溶性膳食纤维溶胀度和持水力分别达到11.52 mL/g、7.32 g/g，符合高品质膳食纤维的要求。这为推动韭菜籽资源的充分利用，开发新型水溶性膳食纤维产品提供了试验基础。

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Preparation of Soluble Dietary Fiber from Chinese Leek Seed Meal by Mixed Fermentation

SUN Jie1，YIN Guo-you1，WANG Chao2，WANG Qi3，LI Wen-jian1，ZHANG Xian-qing1
（1.College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036，Henan，China；2.College of Life and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，Zhejiang，China；3.Guelph Food Research Centre，Agriculture and Agri-Food Canada，Guelph N1G5C9，Ontario，Canada）

In this study，we studied the preparation of soluble dietary fiber from Chinese leek seed meal by mix-fermentation and investigated the effects of ratios of material and liquid，fermentation time，the proportion of mixed bacteria and inoculum on yield of SDF by single factor.Then the extraction technology was optimized by L9（34）orthogonal test to determine the best process conditions.The optimal extraction process was found as follows：ratios of material and liquid is 1 ∶20（g/mL），fermentation time was 72 hours，the proportion of mixed bacteria was 2∶1 and the inoculum was 10%，the yield of soluble dietary fiber was 33.28%.Moreover，the degree of swelling of soluble dietary fiber preparation and holding capacity reached 11.52 mL/g and 7.32 g/g separately，in line with the requirements of high-quality dietary fiber.

soluble dietary fiber；mix fermentation；Chinese leek seed meal；yield

2016-08-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.021

河南省科技计划重点科技攻关项目（132102210192；152102210091）；河南省产学研合作项目（152107000052）；河南省高等学校重点科研项目（17A550008）

孙婕（1976—），女（汉），副教授，博士，研究方向：天然产物分离纯化及功能性质研究。