余甘子多酚α-葡萄糖苷酶抑制及抗氧化作用

王锐

（昭通学院化学与生命科学学院，云南昭通657000）

余甘子多酚α-葡萄糖苷酶抑制及抗氧化作用

王锐

（昭通学院化学与生命科学学院，云南昭通657000）

采用α-葡萄糖苷酶抑制模型，研究余甘子多酚提取物（polyphenol extracts from Phyllanthus emblica L.，PEPs）对α-葡萄糖苷酶抑制作用，并通过PEPs还原能力及自由基清除试验，测定其抗氧化作用。结果表明，PEPs能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率可达95.71%，半数抑制浓度（IC50）为0.71 mg/mL。PEPs具有一定的还原能力，在0.01 mg/mL～0.03 mg/mL，PEPs的还原能力与维生素C（Vitamin C，VC）相当。PEPs能有效清除自由基，其清除羟基自由基（·OH）和 1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）的 IC50值分别为 0.77 mg/mL、5.23 mg/L，清除 DPPH·的能力高于 VC，且PEPs对α-葡萄糖苷酶的抑制及抗氧化作用呈剂量依赖关系，PEPs具有很好的开发价值。

余甘子；多酚；α-葡萄糖苷酶；抑制；抗氧化

余甘子（Phyllanthus emblica L.）为大戟科叶下珠属植物余甘子的成熟果实，主产于热带、亚热带的印度、斯里兰卡、马来西亚及我国云南、贵州、福建、广西、广东等地。余甘子性味甘、酸、涩、可清热凉血、消食健胃、生津止咳，自古以来在民间就作为健身和药用水果，被列入既是食品又是药品的名单。余甘子含有丰富的超氧化物歧化酶、维生素、黄酮、皂苷、多糖及多酚等活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抑制病毒、增强免疫力等功效[1-3]。余甘子作为药食同源植物，具有较高的食疗保健价值，已开发出了余甘子酒、罐头、饮料等功能性食品及余甘子口服液、冻干粉等保健产品。在对余甘子营养成分和保健作用的深入研究中发现，余甘子可明显改善胰岛素抵抗，增强机体对胰岛素的敏感性，显著降低血糖[4-7]。随着人们生活水平提高，糖尿病患者逐渐增多，寻找有效的糖尿病治疗药物和保健品成为人们研究的热点。多酚是余甘子的主要功能性成分，目前鲜见余甘子多酚降血糖研究报道[1，8]。本实验用α-葡萄糖苷酶抑制模型，研究余甘子多酚提取物的降血糖作用；由于抗氧化剂能减缓糖尿病患者氧化应激，有助改善糖尿病患者糖代谢，有效预防糖尿病并发症[9-10]，试验同时对余甘子多酚提取物进行了体外抗氧化研究，以期为余甘子开发为糖尿病治疗药物或保健产品提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

余甘子鲜果于当年11月中旬购自云南省昭通市；没食子酸对照品：中国药品生物制品检定所；福林酚（Folin-Ciocalteu，FC）：南京奥多福尼生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、阿卡波糖、1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）：美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ZKF035真空干燥箱：上海实验仪器厂有限公司；XFB-200家用粉碎机：吉首巿中湘制药机械厂；PHS-25数显pH计：上海精密科学仪器有限公司；SK5200LHC超声波洗涤器：上海科导超声仪器有限公司；HH-S601超级恒温水浴锅：金坛市岸头良友实验仪器厂；UV/VIS2802PCS紫外-可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司。

2 方法

2.1 余甘子多酚提取物的制备

将新鲜余甘子清洗去核，70℃烘干粉碎，过60目筛。加入10倍体积石油醚，超声波（35 kHZ，250 W）浸提15 min，除去其中的脂类、色素等成分，抽滤、晾干回收粉末。粉末按料液比1∶20，加入体积分数50%乙醇，超声波（53 kHZ，250 W）浸提 30 min，过滤，滤液减压浓缩、定容，得余甘子多酚提取物（polyphenol extracts from Phyllanthus emblica L.，PEPs），置于 4 ℃冰箱保藏备用[11]。

2.2 PEPs总酚含量的测定

采用福林酚（FC）比色法测定余甘子总酚含量[12]。分别精确量取0.143 2 mg/mL没食子酸溶液0.0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 于 25 mL 比色管中，补充去离子水至5 mL，加入1.5 mL，1 mol/L FC试剂，摇匀，放置2 min。然后，加入3 mL质量分数10%碳酸钠溶液，加去离子水定容至25 mL，摇匀，置于30℃水浴加热30 min，取出冷至室温，以第一管为空白对照，于765 nm波长处测吸光度值，平行测3次，取平均值，用origin软件绘制标准曲线。同法测定余甘子中所提多酚的吸光度值，代入标准曲线线性回归方程，按公式计算出样品中总酚含量。

式中：C为线性方程计算出的质量浓度，（mg/mL）；m为样品质量，g；V1为提取物定容体积，mL；V2为测定时反应体系总体积，mL；V3为吸取测定体积，mL。

2.3 PEPs对α-葡萄糖苷酶抑制作用的测定

取0.5mLα-葡萄糖苷酶溶液（1mg/mL）与一定量的待测样品溶液，补充pH 6.8磷酸钠缓冲液（50 mmol/L）至混合溶液体积为3.5 mL，混匀，37℃孵育10 min，加入4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）溶液0.5 mL（20 mmol/L），于37℃恒温反应30 min后，加入1 mL碳酸钠溶液（1 mol/L）终止反应，室温下平衡10 min，于405 nm波长处测定吸光度值。以阿卡波糖为阳性对照，试验平行测定3次，求平均值，按下列公式计算抑制率[13]。用origin软件绘制抑制曲线图，求出相应的半数抑制浓度（IC50）。

式中：ODa为空白对照溶液的吸光度值；ODb为空白对照溶液的本底吸光度值；ODe为加入样品后溶液的吸光度值；ODf为样品溶液的本底吸光度值。

2.4 PEPs抗氧化作用的测定

采用普鲁士蓝法、羟基自由基（·OH）清除法和1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）清除法测定PEPs的抗氧化能力，并以维生素C（Vitamin C，VC）做阳性对照进行比较。

2.4.1 还原能力测定

参考刘以娟等[14]的方法，在2.5 mL，pH 6.6磷酸钠缓冲溶液（0.2 mol/L）中加入2.5 mL待测样品溶液及2.5 mL质量浓度1%铁氰化钾溶液，混匀，50℃恒温反应20 min后，加入2.5 mL质量浓度1%三氯乙酸溶液，然后以3 000 r/min离心分离10 min，取2.5 mL上清液，在其中加入2.5 mL去离子水和0.5 mL质量浓度0.1%三氯化铁溶液，混匀室温反应10 min，于700 nm波长处测吸光度值。试验平行测定3次，取平均值，并用origin软件绘制吸光度值图。

2.4.2·OH清除能力测定

在试管中分别加入待测溶液，水杨酸溶液（9 mmol/L），硫酸亚铁溶液（9 mmol/L）各 2 mL，最后加入过氧化氢溶液（8.8 mmol/L）2 mL，启动反应，37℃恒温反应30 min后，取出冷至室温，在510 nm波长处测定混合溶液的吸光度值，平行测定3次，取平均值，依据下列公式计算自由基清除率[15]。通过origin软件绘制抑制曲线图，求出IC50值。

式中：ODx为加入待测溶液后的吸光度值；ODxo为待测溶液的本底吸光度值；ODo为空白对照溶液的吸光度值。

2.4.3 DPPH·清除能力测定

取2mL样品溶液与2mLDPPH·溶液（1×10-4mol/L），混合均匀，25℃恒温反应30 min后，于517 nm波长处测定其吸光度值ODx，平行测定3次，取平均值。同时，同法测定2 mL溶剂与2 mL DPPH·溶液的吸光度值ODo，2 mL样品溶液与2 mL溶剂的吸光度值ODxo，代入自由基清除率公式，计算出样品的DPPH·清除率[15]，并通过origin软件绘制抑制曲线图，求出相应IC50值。

3 结果与分析

3.1 PEPs中总酚含量

以吸光度值（Y）对没食子酸浓度（X）绘制标准曲线，得线性回归方程Y=0.049 1 X+0.004 7（R=0.999 6）。将同法测定样品溶液的吸光度值代入回归方程，通过总酚含量公式计算得到余甘子多酚提取物中总酚含量为403.64 mg/g，表明余甘子中含有丰富的多酚类化合物。

3.2 PEPs对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

通过α-葡萄糖苷酶抑制模型，测定不同浓度PEPs对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，结果如图1所示。

图1 余甘子多酚提取物和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PEPs and Acarbose on α-glucosidase

由图1可知，PEPs对α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，在试验条件下，其IC50为0.71 mg/mL。IC50值越低，则抑制活性越强。相较于阳性对照阿卡波糖（IC50为0.04 mg/mL），PEPs抑制作用低于阿卡波糖。低浓度时，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶具有剂量依赖性抑制，当浓度高于0.35 mg/mL，其抑制作用不再随浓度增大而增强，抑制率几乎维持在85%左右。而PEPs在0.25 mg/mL～1.5 mg/mL，抑酶效果随着PEPs质量浓度的增大而增强，当PEPs为1.5 mg/mL时抑制率达到95.71%，若其浓度继续增大几乎可完全抑制α-葡萄糖苷酶的活性。表明，PEPs对α-葡萄糖苷酶的抑制作用与其浓度之间有明显的量效关系，PEPs是一种理想的α-葡萄糖苷酶抑制剂，具有一定降血糖作用。

3.3 PEPs的抗氧化作用

3.3.1 PEPs的还原能力

体系中的抗氧化剂将铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，使其与三氯化铁反应生成普鲁士蓝，700 nm波长处有最大吸收，所测吸光度值越大，还原能力越强，表明样品的抗氧化性能越强。以VC为阳性对照，测定了PEPs的还原能力，结果见图2。

图2 余甘子多酚提取物和维生素C的还原能力Fig.2 Reducing ability of PEPs and VC

由图2可见，PEPs具有一定的还原能力，其还原能力随着PEPs浓度的增大而增强，呈剂量效应关系。低浓度（0.01 mg/mL～0.03 mg/mL）时，PEPs的还原能力与VC相当，但随着浓度升高，PEPs的还原能力低于VC。

3.3.2 PEPs对·OH的清除作用

自由基的清除率越高表明提取物的抗氧化活性越强。PEPs对·OH的清除作用见图3。

图3 余甘子多酚提取物和VC对·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of PEPs and VCon·OH

如图3所示，PEPs对·OH具有一定的清除作用，且与浓度呈计量关系，当PEPs浓度为2 mg/mL时，清除率为96.09%。与阳性对照VC相比，PEPs的IC50为0.77 mg/mL，高于 VC（IC50为 0.17 mg/mL），表明 PEPs清除·OH的能力低于VC。

3.3.3 PEPs对DPPH·的清除作用

以质量浓度（mg/L）为横坐标，清除率（%）为纵坐标，绘制自由基清除率曲线，如图4所示。

图4 余甘子多酚提取物和VC对DPPH·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of PEPs and VCon DPPH·

由图4可以看出，PEPs对DPPH·具有很强的清除能力，在试验浓度 3.75 mg/L～11.25 mg/L，PEPs剂量依赖性清除DPPH·，在11.25 mg/L时，清除率达到了98.22%。与阳性对照比较，PEPs清除DPPH·的IC50为5.23 mg/L，低于VC的IC50（6.14 mg/L），表明PEPs清除DPPH·的能力强于VC。

4 结论与讨论

通过体外α-葡萄糖苷酶抑制及抗氧化实验，表明PEPs能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，抑制率可达95.71%，IC50为0.71 mg/mL；PEPs具有一定的还原能力，PEPs能有效清除自由基，清除·OH和DPPH·的IC50值分别为0.77 mg/mL、5.23 mg/L。PEPs与阳性对照相比较，除对DPPH·的清除能力较强外，其余均弱于阳性对照，这或许与PEPs的纯度有关。下一步将对PEPs进行分离、纯化，并对主要活性组分的作用机制进行研究。

多酚是存在于植物中的一类化合物，它可增加胰岛β细胞增殖，促进胰岛素分泌，提高血清中胰岛素含量；同时，多酚能清除体内过多自由基，减少过氧化脂质，从而有效降低血糖、控制糖尿病及并发症的发生与发展。现在广泛应用临床的如阿卡波糖、伏格列波糖及米格列醇等降糖药虽具有强烈的抑制作用，但通常对肝脏及胃肠道产生副作用。相较于人工合成药，天然植物多酚作用温和持久，副作用小[16]。余甘子作为药食两用植物，其急性毒性实验表明无明显毒副反应，这为余甘子的开发利用提供了安全依据[17]。余甘子中富含多酚类化合物，多酚含量为403.64 mg/g。余甘子多酚提取物不仅对α-葡萄糖苷酶活性产生抑制作用，而且还有一定抗氧化能力，具有很好的抗糖尿病功能食品的开发价值。

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Inhibition Effect on α-Glucosidase and Antioxidant Activity for Polyphenol Extracts from Phyllanthus emblica L.

WANG Rui
（College of Chemistry and Life Science，Zhaotong University，Zhaotong 657000，Yunnan，China）

The model of α-glucosidase inhibition was used to determine the inhibition effect of polyphenol extracts from Phyllanthus emblica L.（PEPs）on α-glucosidase.And the antioxidant activity of PEPs was also studied by reducing power and radical scavenging test.The results indicated that PEPs showed good inhibition activity on α-glucosidase，its maximum inhibition rate was up to 95.71%，and half inhibitory concentration（IC50）of PEPs was 0.71 mg/mL.PEPs had a certain reducing power，its reducing power was almost identical to Vitamin C（VC）in the concentration range of 0.01 mg/mL-0.03 mg/mL.PEPs had better scavenging effect on hy droxylfreeradical（·OH）and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical（DPPH·），theIC50were0.77mg/mL，5.23 mg/L respectively，and the scavenging effect on DPPH·was better than VC.Meanwhile PEPs showed dose dependent for the inhibition activity on α-glucosidase and antioxidant activity.So it has the very good development value.

Phyllanthusemblica L.；polyphenol；α-glucosidase；inhibition；antioxidant

2017-02-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.004

王锐（1976—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：天然产物化学研究。