甜茶中齐墩果酸及熊果酸的检测方法的建立

谭冬明，石相莉，*，罗星晔，农彦贤，梁炜，黄健

（1.桂林市产品质量检验所，广西桂林541004；2.桂林市环境监测中心站，广西桂林541002）

甜茶中齐墩果酸及熊果酸的检测方法的建立

谭冬明1，石相莉1，*，罗星晔2，农彦贤1，梁炜1，黄健1

（1.桂林市产品质量检验所，广西桂林541004；2.桂林市环境监测中心站，广西桂林541002）

建立测定甜茶中齐墩果酸及熊果酸的高效液相色谱分析方法。对色谱分析条件及样品前处理进行优化研究，样品经乙醇超声波提取，醇提水沉进行杂质沉淀，以Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为分析柱，甲醇和0.2%乙酸铵溶液（83∶17）为流动相，检测波长为210 nm，流速为0.6 mL/min，外标法进行定量。在此条件下，齐墩果酸及熊果酸能达到完全基线分离，分别在2.23 μg/mL～112 μg/mL、1.84 μg/mL～92 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系（R2＞0.999），方法检出限分别为 0.04、0.08 g/kg。在低中高 3 种含量添加水平的回收率在 92%～102%，RSD（n=6）为0.8%～3.8%。

甜茶；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱

广西甜茶（Rubus Suavissimus S.Lee）是广西特有的具有较高食用价值和药用价值的甜味植物。叶中特有的甜茶苷是一种低热值、高甜度、安全无毒的天然甜味物质，是糖类物质的理想替代品。甜茶具有清热、润肺、止咳等功效，民间将其作为茶的饮用历史悠久[1]。甜茶苷、黄酮类、多酚类是甜茶的主要活性成分[2]。经文献查阅，目前对甜茶的研究主要集中在甜茶苷、黄酮类、多酚类的提取工艺[3-8]及其相应的生物活性[9-23]。研究表明，甜茶具有抗氧化[9-11]、抗过敏[12-13]、抗肿瘤[14-15]、降血糖[16]、降血脂[17]、降血压[18]、抗疲劳及免疫增强[19]、抑制变形链球菌作用[20]。有文献报道甜茶苷和抗癌药物生成纳米粒子复合物，可较大程度提高抗癌药物的作用[21-23]。谭冬明[24]通过提取分离及波谱学方法鉴定甜茶叶中含有齐墩果酸、熊果酸。齐墩果酸具有抗HIV、抗菌、抗癌、抗溃疡、治疗骨质疏松症等广泛的药理作用和生物活性，作为保肝药物已经用于临床[25-26]。熊果酸具有抗肿瘤、护肝、心血管、糖尿病、抗炎、抗病毒等多种生物活性，在国内外受到了广泛的研究[27]。目前对广西甜茶中齐墩果酸和熊果酸的定量分析未见相关报道。本试验研究建立同时测定甜茶中齐墩果酸及熊果酸含量的高效液相色谱分析方法，为甜茶的进一步研究和开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜茶叶：分别由来宾市金秀瑶族自治县金秀县艺耕堂茶庄及桂林市平乐县永康汉方茶业科技有限公司提供；齐墩果酸、熊果酸标准物质（纯度为≥98%）：成都普菲德生物技术有限公司；甲醇（色谱纯）：美国Tedia公司；乙酸铵（分析纯）：广东光华科技股份有限公司；无水乙醇（分析纯）、乙醚（分析纯）：西陇化工股份有限公司；试验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

U3000液相色谱仪（配有DAD检测器）：美国赛默飞世尔公司；SyncoreR12型旋转浓缩仪：瑞士步琦有限公司；AS2060B型超声波：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；TG16-WS型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Elix essential15型纯水机：德国默克密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别准确称取齐墩果酸0.044 6 g，熊果酸0.036 8 g置于10 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，浓度分别为4.460、3.680 mg/mL。分别准确量取一定体积的该标准混合液用70%乙醇水（体积比）逐级稀释至不同浓度系列，齐墩果酸浓度为 2.23、4.46、11.2、22.3、44.6、112 μg/mL，熊果酸浓度为 1.84、3.68、9.20、18.4、36.8、92.0 μg/mL。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：赛默飞世尔Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（83∶17），流速：0.6 mL/min，柱温：30℃，检测波长：210 nm，进样体积：20 μL，光谱扫描范围：190 nm～600 nm。

1.3.3 样品处理

准确称取捣碎后的样品0.8 g置于150 mL锥形瓶中，加入10 mL乙醇超声提取10 min，放置10 min，将上清液慢慢倾斜倒入25 mL容量瓶中，再用10 mL乙醇洗涤残渣1次，合并洗涤液，用乙醇定容至刻度，摇匀。将乙醇提取液在4 000 r/min下离心5 min，准确量取离心后的溶液7.0 mL于10 mL容量瓶中，缓慢逐滴加水至刻度，摇匀后放置10 min，将溶液过0.45 μm有机系滤头，上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的确定

采用二极管阵列检测器（DAD）对齐墩果酸、熊果酸混标溶液在1.3.2中流动相分析条件下进行波长（190 nm～600 nm）扫描。从各自的吸收光谱图可知，由于齐墩果酸与熊果酸为同分异构体，两者结构及极性极为相似，仅表现在甲基位置的不同，两个甲基都在20位为齐墩果酸（图1），分别在19、20位为熊果酸（图2），两者的扫描吸收光谱图相似，其最大吸收波长分别为205、206 nm。甲醇在该波长处附近具有较强背景吸收，且本试验流动相条件中甲醇比例较高（83%），考虑到分析灵敏度、基线的稳定性及背景干扰，本试验采用210 nm作为检测波长。

图1 齐墩果酸Fig.1 Oleanolic acid

图2 熊果酸Fig.2 Ursolic acid

2.1.2 色谱柱的选择

齐墩果酸与熊果酸互为同分异构体，比较难以分离。本试验分别研究了赛默飞世尔Hypersil Gold C18、菲罗门Luna C8、菲罗门Gemini C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对两种物质的分离效果。Hypersil Gold C18及Gemini C18柱均能取得较好的分离效果，基线能达到完全分离，目标组分在两种柱子上的分离度（R）分别为1.6、1.5，而采用Luna C8柱分析时，目标组分完全分不开，两峰合并在一起，色谱图分别见图3（a）、图3（b）、图 3（c）。Gemini C18柱对两种物质的保留能力较强，出峰时间在37 min～39 min之间，分析耗时较长，且色谱峰峰宽较大，峰宽（50%）均为0.64。采用Hypersil Gold C18柱分析时，两种物质峰形较好且尖锐，峰宽（50%）均为0.38，出峰时间比较合适。为了进一步分析Gemini C18柱对目标组分的分离效果，将流动相流速改为1 mL/min，其余条件同1.3.2。结果表明，目标组分的出峰时间大大缩短，在22 min～24 min之间出峰，峰宽变窄（0.45），但分离度降低至1.3，两峰发生小部分重叠，且甲醇试剂用量大，色谱图见图3（d）。综合考虑，本试验选择赛默飞世尔Hypersil Gold C18作为分析柱。

2.1.3 流动相的试验研究

采用赛默飞世尔Hypersil Gold C18为分析柱，本试验研究比较了分别以甲醇-0.2%乙酸铵水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相及不同比例甲醇含量对齐墩果酸、熊果酸的分离影响。两种流动相体系的分离效果相差较大。采用甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（83∶17）的分离效果较好，见图3（a）。当流动相比例改为甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（85∶15）时，两峰发生小部分重叠，分离度降为1.3，未达到基线完全分离效果，色谱图见图4（e）。采用甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相时，分离效果较差，出峰时间较甲醇-0.2%乙酸铵水溶液体系长，改变流动相比例分别为83∶17、85∶15时，两者分离度分别仅为1.1、1.0，两峰重叠部分较多，且色谱峰峰宽增大，部分色谱图见图4（f）。为满足分析要求，本试验选择甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（83∶17）为流动相分析体系。

图 3 （a）Hypersil Gold C18、（b）Gemini C18、（c）Luna C8及（d）Gemini C18（1 mL/min）的分离色谱图Fig.3 Separation chromatograms of Hypersil Gold C18（a），Gemini C18（b），Luna C8（c）and Gemini C18（1 mL/min）（d）

图4 （e）甲醇-0.2%乙酸铵水溶液（85∶15）及（f）甲醇-0.1%磷酸水溶液（83∶17）的分离色谱图Fig.4 Separation chromatograms of methanol-0.2%ammonium acetate solution（e）and methanol-0.1%phosphoric acid solution（f）

2.1.4 流速对分离效果的影响

试验研究比较了流动相流速分别为0.6、0.8、1.0 mL/min时对目标组分分离效果的影响。流速不同，齐墩果酸与熊果酸的出峰时间、分离度、峰面积等发生不同程度的改变。流速越大，组分峰出峰时间越早，齐墩果酸由22 min减至13 min出峰，熊果酸由23 min减至14 min出峰，两峰分离度越低，从1.6降至1.4，分离效果越差。峰面积与流速成反比，如流速在0.6、0.8、1.0 mL/min时，齐墩果酸相应的峰面积为13.878、10.057、7.907 mAU，熊果酸相应的峰面积为10.206、7.420、5.705 mAU，峰面积均大幅度减少，灵敏度大幅降低。综合考虑灵敏度、分离度、出峰时间等因素，本试验设定流动相流速为0.6 mL/min。

2.1.5 柱温对分离效果的影响

试验研究比较了柱温分别为30、35、40℃时对目标组分分离效果的影响。结果表明，柱温越高，流动相洗脱能力增强，出峰时间缩短，但两组分的分离度减小，如与柱温30℃相比，柱温在40℃时，齐墩果酸在18.253 min出峰，提前了3.59 min，两峰分离度为1.4，两峰有部分重叠，低于柱温30℃时的分离度（R=1.6），影响检测结果的准确定量。因此本试验将柱温设定为30℃。

2.2 样品的前处理优化

2.2.1 提取溶剂的确定

试验考察了不同体积比的60%甲醇水、70%甲醇水、80%甲醇水、甲醇、60%乙醇水、70%乙醇、水、80%乙醇水、乙醇及乙醚的提取效果。采用称取0.5 g样品，分别用10 mL提取溶剂超声提取20 min，再用提取溶剂10 mL洗涤残渣1次，合并提取液及洗液，加提取溶剂定容至25.0 mL，其中将乙醚提取液低温下浓缩挥干乙醚，用甲醇溶解定容至25.0 mL，各提取液过0.45 μm有机系滤头，上机测定。结果表明，乙醇水提取溶剂的提取效果均高于同体积比的甲醇水溶剂。在甲醇水体系中，甲醇比例越高，提取效果越高，如熊果酸分别在60%甲醇水、70%甲醇水、80%甲醇水、甲醇中的提取含量为 0.30、0.83、1.08、1.07 g/kg，甲醇含量只有较高时（80%），才能将目标组分提取完全。乙醚的提取效果与乙醇水一致，但提取过程较复杂。在乙醇水体系中，60%乙醇水、70%乙醇水、80%乙醇水的提取效果基本一致，乙醇含量在60%时即可将目标组分提取完全，如熊果酸在3种提取溶剂中的提取含量均为1.08 g/kg，说明乙醇具有较好的提取效果，但直接采用乙醇提取时，提取出的杂质成分较多，峰形较差，影响目标组分的分离分析，色谱图见图5（a）。同时，采用甲醇水体系、乙醇水体系、乙醚提取时均出现同一干扰峰与齐墩果酸分不开，影响齐墩果酸的定量分析，色谱图见图5（b）。本试验研究采用醇提水沉方法进行杂质去除，即取乙醇提取液加入一定量的水，获得较好的杂质去除效果，色谱图见图5（c）。通过对加入一定量水沉淀后的溶液进行分析，结果显示齐墩果酸及熊果酸的提取含量的准确分析未受影响。因此，本试验提取溶剂选择乙醇，该溶剂试验安全，且经济实惠。

图5 （a）乙醇、（b）70%乙醇及（c）乙醇提水沉的提取分离色谱图Fig.5 Extraction and Separation chromatograms of ethanol（a）and 70%ethanol（b）and extracted by ethanol and precipitated by water（c）

2.2.2 加入水量的影响研究

试验考察了在乙醇提取液中加入不同体积量的水对杂质沉淀的影响，以及对齐墩果酸及熊果酸的分析影响。分别取按1.3.3处理得到的乙醇提取液5.0、6.0、7.0、8.0 mL，依次缓慢逐滴加入水 5.0、4.0、3.0、2.0 mL，按1.3.2及1.3.3处理分析。结果表明，加入4种体积量的水均能去除齐墩果酸的干扰峰，并能不同程度沉淀色素，加入水体积越大，色素沉淀效果越明显，溶液颜色越浅，但水的体积增大会同时造成齐墩果酸及熊果酸的沉淀析出，致使结果偏低。在加入水5.0、4.0、3.0、2.0 mL后，齐墩果酸的分析结果分别为0.206、0.262、0.261、0.267 g/kg，熊果酸的分析结果分别为0.787、1.06、1.08、1.07 g/kg，加入水 5.0 mL 虽然能明显去除色素，但是齐墩果酸及熊果酸较大程度同时析出，导致结果明显偏低，其它3种加入水的体积量的分析结果基本一致。为了保证目标组分的充分保留，本试验选择7.0 mL乙醇提取液中加入3.0 mL水作为醇提水沉的方法。

2.2.3 样品称样量的确定

试验考察了称样量分别为 0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 g时，按1.3.3处理对齐墩果酸及熊果酸提取的分析影响。结果表明，改变称样质量，齐墩果酸及熊果酸的含量分析结果基本一致，说明采用超声波乙醇提取具有较好的提取效果。称样量越大，上机时处理液色素颜色越深，杂质成分越多，基质越复杂。称样量低，样品代表性较差。综合考虑，本试验选择0.8 g作为称样质量。

2.2.4 提取时间的确定

试验考察了超声时间分别为10、15、20 min对齐墩果酸及熊果酸提取的影响。改变超声时间，其余按1.3.3处理进行分析。结果表明，在超声时间分别为10、15、20 min时，齐墩果酸的分析结果分别为0.270、0.261、0.263 g/kg，熊果酸的分析结果分别为 1.06、1.05、1.07 g/kg。增加超声时间，齐墩果酸及熊果酸的提取效果基本一致。因此，为提高分析效率及减少杂质干扰，本试验选择超声时间为10 min。

2.2.5 提取次数的确定

试验考察了提取次数分别为1、2次对齐墩果酸及熊果酸提取的影响。提取1次试验按照1.3.3处理分析，第2次提取操作与第1次一致，合并2次提取液，用乙醇定容至25.0 mL，其余按照1.3.3处理分析。结果表明，提取次数分别为1、2次时，齐墩果酸的结果为0.270、0.266 g/kg，熊果酸的结果为 1.06、1.08 g/kg，提取1次与提取2次的效果基本一致。因此，本试验选择提取次数为1次。

2.3 方法学分析

2.3.1 方法的线性关系和检出限

将1.3.1配制的不同浓度系列进样分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，以3倍信噪比计算方法检出限。结果表明，齐墩果酸在2.23 μg/mL～112 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，回归方程为：y=0.280 8x+0.278 4，相关系数（R2）为 0.999 9，检出限为 0.04 g/kg。熊果酸浓度在 1.84 μg/mL～92.0 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，回归方程为：y=0.261x-0.062 2，相关系数（R2）为 0.999 8，检出限为0.08 g/kg。标准曲线分别见图6和图7，标准溶液图谱见图3（a），本研究相关图谱中峰序号1为齐墩果酸，2为熊果酸。

图6 齐墩果酸标准曲线Fig.6 The standard curve of oleanolic acid

图7 熊果酸标准曲线Fig.7 The standard curve of ursolic acid

2.3.2 回收率和精密度

按本试验条件分析样品本底值，同时分别做低中高3种含量添加水平的加标试验，按1.3.2及1.3.3处理分析，计算回收率和精密度，每个添加水平分别进行6平行试验，结果见表1。结果显示精密度和回收率良好，方法准确性高。

表1 回收率和精密度分析结果Table 1 Determination results of precision and recovery

2.3.3 实际样品测定

分别对4个甜茶样品（2个产自来宾市金秀县，2个产自桂林市平乐县）按本方法进行检测，产自平乐县的2个甜茶样品中的齐墩果酸和熊果酸含量均较低，齐墩果酸含量分别为0.058 4、0.056 2 g/kg，熊果酸含量分别为0.426、0.411 g/kg，产自金秀县的2个甜茶样品中的齐墩果酸和熊果酸含量高于产地平乐县的样品，齐墩果酸含量分别为0.261、0.273 g/kg，熊果酸含量分别为 1.08、1.12 g/kg。

3 结论

本文通过对色谱分离分析条件及样品前处理优化的详细研究，建立同时测定甜茶中齐墩果酸及熊果酸的高效液相色谱分析方法。样品经乙醇超声波提取，采用醇提水沉方法较好的去除齐墩果酸干扰峰，前处理操作简单。齐墩果酸及熊果酸在本试验方法条件下能达到完全分离，线性关系、回收率、精密度均良好。该方法简便快捷、准确度高，适用于甜茶中齐墩果酸及熊果酸含量的检测分析，为甜茶的综合研究与开发提供基础。

[1]邓绍林.广西甜茶叶片的营养成分及开发利用价值研究[J].中国林副特产,2000,54(3)：18-19

[2]郑华,苏志恒.广西甜茶的药理学研究进展[J].广西医科大学学报,2015,32(1)：149-151

[3]吴婕,鲍展阳,杜莹,等.SA-3大孔树脂纯化甜茶素的研究[J].食品研究与开发,2014,35(23)：36-39

[4]吕鑫华,况鹏群,袁其朋,等.制备色谱法在纯化甜茶苷工艺中的应用[J].北京化工大学学报(自然科学版),2012,39(5)：92-97

[5]刘庚贵,唐克军,罗习,等.利用“广西甜茶”生产≥98%甜茶素的新工艺[J].企业科技与发展,2014,368(4)：11-12

[6]程雅芳,杨洋,韦银凤,等.超声波辅助提取甜茶黄酮的工艺优化[J].食品科技,2011,36(4)：189-193

[7]程雅芳,杨洋,温富雄,等.响应面分析法优化酶提取甜茶茶多酚工艺[J].食品科学,2012,33(10)：11-15

[8]滕昭玉,崔紫姣,杜莹,等.甜茶总多酚的纯化及其抗氧化活性[J].安徽农业科学,2016,44(1)：36-39

[9]谭冬明,罗星晔,陈全斌.广西甜茶水提取物中不同分离部位的抗氧化性研究[J].中国食品添加剂,2016,148(6)：125-129

[10]薛茗月,罗星晔,湛志华,等.甜茶中鞣花酸抗氧化作用研究[J].安徽农业科学,2012,40(2)：777-779

[11]湛志华,薛茗月,李晓红,等.甜茶果实水提物HPLC分析及抗氧化性分析[J].南方农业,2015,9(30)：168-170

[12]薛茗月,罗星哗,湛志华,等.甜茶中鞣花酸抗过敏实验研究[J].食品研究与开发,2012,33(11)：208-210

[13]王慧,王建壮,王剑霞,等.广西甜茶二萜成分抗过敏作用研究[J].广东药学院学报,2014,30(1)：60-62

[14]黄荣岗,杨家庆,何家靖,等.广西甜茶提取物体内抗肿瘤实验研究初探[J].广东药学院学报,2012,28(2)：173-175

[15]吴燕春,吴冬,谢金鲜,等.广西甜茶总黄酮的体外抗肿瘤作用[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(7)：165-167

[16]谢莹,陈全斌,罗达伟,等.高纯度甜茶甙对四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影响[J].陕西中医,2010,31(3)：367-368

[17]KOH G Y,MCCUTCHEON K,ZHANG F,et a1.Improvement of obesity phenotype by Chinese sweet leaf tea(Rubus suavissimus)components in high-fat diet-induced obese rats[J].J Agric Food Chem,2011,59(1)：98-104

[18]蒋荣华,候小利,王硕,等.甜茶多酚对自发性高血压大鼠的影响[J].世界科学技术：中医药现代化,2015,17(7)：1479-1485

[19]胡楠,熊兴耀.甜茶苷对变形链球菌致龋能力的影响[J].中草药,2014,45(12)：1743-1746

[20]谢莹,陈全斌,罗达伟,等.高纯度甜茶苷抗疲劳及免疫调节功能研究[J].时珍国医国药,2010,21(6)：1421-1422

[21]ZHANG F,KOH G Y,HOLLINGSWORTH J,et a1.Reformulation of etoposide with solubility-enha ncing rubusoside[J].Int J Pharm,2012,434(1/2)：453-459

[22]ZHANG F,KOH G Y,JEANSONNE D P,et a1.A novel solubilityenhanced curcumin formulation showing stability and maintenance of anticancer activity[J].J Pharm Sci,2011,100(7)：2778-2 789

[23]LIU Z,ZHANG F,KOH G Y,et a1.Cytotoxic and antiangiogenic paclitaxel solubilized and perm eation-enhanced by natural product nanoparticles[J].Anticancer Drugs,2015,26(2)：167-179

[24]谭冬明.广西甜茶叶的化学成分研究[D].桂林：广西师范大学,2008

[25]刘颖,刘登科,刘默,等.齐墩果酸的药理作用和结构修饰[J].中草药,2009,40(S1)：21-23

[26]唐初,陈玉,柏舜,等.齐墩果酸的结构修饰与生物活性研究进展[J].有机化学,2013,33(1)：46-65

[27]张新华,朱萱.熊果酸药理学的最新研究进展[J].中国中西医结合杂志,2011,31(9)：1285-1289

Establishment for the Determination of Oleanolic Acid and Ursolic Acid from Rubus Suavissimus S.Lee

TAN Dong-ming1，SHI Xiang-li1，*，LUO Xing-ye2，NONG Yan-xian1，LIANG Wei1，HUANG Jian1
（1.Guilin Product Quality Testing Institute，Guilin 541004，Guangxi，China；2.Guilin Environmental Monitoring Center，Guilin 541002，Guangxi，China）

A method was proposed for the determination of oleanolic acid and ursolic acid from Rubus suavissimus S.Lee by high performance liquid chromatography.The optimization of chromatographic analysis condition and sample pretreatment were studied.The sample was extracted by ethanol.The impurity was removed by ethanol extraction and water precipitation.The separation was completed by using Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column with carbinol and 0.2%acetic ammonium solution （83 ∶17）as the mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min，and the detection wavelength was 210 nm.The quantification was performed by the external standard method.Under these conditions，oleanolic acid and ursolic acid were completely separated，and it showed good linearities with their concentrations ranged from 2.23 μg/mL to 112 μg/mL and from 1.84 μg/mL to 92 μg/mL with correlation coefficients（R2）more than 0.999，and the detection limits were 0.04 and 0.08 g/kg.The recoveries were in the range of 92%-102%at 3 spiked levels with RSDs（n=6）of 0.8%-3.8%.

Rubus Suavissimus S.Lee；oleanolic acid；ursolic acid；high performance liquid chromatography（HPLC）

2017-04-05

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.033

桂林市科技攻关项目（2016010307）

谭冬明（1982—），男（汉），工程师，硕士，主要从事食品质量分析与研究。

*通信作者：石相莉（1969—），女，高级工程师，主要从事食品质量分析与研究。