苦荞蛋白酶解产物的抗氧化活性研究

陈花，张海悦，王鹏

（长春工业大学化学与生命科学院，吉林长春130012）

苦荞蛋白酶解产物的抗氧化活性研究

陈花，张海悦*，王鹏

（长春工业大学化学与生命科学院，吉林长春130012）

以苦荞麦为原料，通过碱提酸沉法提取蛋白质复合物，并利用单因素试验和响应面软件优化最佳蛋白质提取工艺，优化结果为提取时间50 min，料液比1∶12（g/mL），提取温度55℃，pH 10.0。正己烷去除苦荞麦蛋白质复合物中的黄酮类化合物和脂类。碱性蛋白酶酶解苦荞麦蛋白制备酶解液，研究不同水解度的酶解液的总抗氧化能力，超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基的清除能力，结果表明不同水解度的苦荞蛋白酶解液都具有抗氧化能力。但具有不同的自由基清除活力，其中超氧阴离子自由基的清除活性最大，其次是DPPH自由基清除活性，几乎不具有羟自由基清除活性。

苦荞麦蛋白；响应面软件分析；蛋白酶解产物；抗氧化能力

苦荞麦属于蓼科双子叶植物，含有多种活性成分，具有抗氧化、降血压等作用。目前国内外对苦荞麦的研究大多集中于黄酮类化合物，对蛋白质的研究极少，而苦荞麦中蛋白质的含量特别丰富（13.45%），是黄酮类化合物（3.25%）的4倍[1]，且苦荞麦蛋白质氨基酸组成均衡，富含赖氨酸、苯丙氨酸等多种人体必需的氨基酸，是一种生物效价很高的蛋白质。

近年国内外科研人员不断发现，经蛋白酶水解后的苦荞蛋白酶解产物，能降血压、肝脏胆固醇，抑制体内脂肪蓄积，促进排泄、改善便秘，抑制肿瘤、延缓衰老，抑制有害物的吸收等作用[2]。

本文在提高提取率的基础上优化苦荞麦蛋白的提取工艺，探讨其不同水解度的酶解产物的总抗氧化能力以及对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基的清除能力。为苦荞麦及苦荞麦蛋白的进一步开发研究做基础。

1 材料与设备

1.1 原材料与试剂

苦荞麦：吉林省松原市北显粮油贸易发展有限公司；碱性蛋白酶：南宁庞博生物工程有限公司。考马斯亮蓝：金泰化玻生物工程公司；总抗氧化能力（T-）试剂盒：上海阳光试剂公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 设备

电子天平（AL204）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；分光光度计（UV75）：上海佑科仪器仪表有限公司；冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

2 方法

2.1 蛋白质含量测定

参考GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[3]中的分光光度法测测定原料苦荞麦中的蛋白质含量。根据王孝平等[4]考马斯亮蓝法测蛋白质含量的研究方法，并稍作改进，建立了快速测提取液中蛋白质含量的方法。

2.2 苦荞麦蛋白质提取

首先将苦荞麦原料粉碎，然后选择合适的料液比、提取时间、提取温度、pH值等提取条件进行苦荞麦蛋白提取，过滤，离心除去杂质得到上清液，调节上清液的pH值至苦荞麦蛋白的等电点，多次沉淀，离心得到得沉淀苦荞麦蛋白复合物（BWEP）。

2.3 去除脂类、黄酮类化合物

将上述得到的的蛋白质复合物（BWEP）用正己烷萃取3次，离心得到苦荞麦蛋白质[5]。

2.4 试验设计

在提取过程中，以提取率为指标，采用单因素试验研究料液比、提取时间、提取温度、pH值对苦荞麦蛋白质提取的影响，并在此研究的基础上利用响应面软件对提取条件进行优化，试验设计因素，水平及实验结果记录如表1。

表1 响应面试验设计和结果Table 1 The experimental scheme and result table

续表1 响应面试验设计和结果Continue table 1 The experimental scheme and result table

2.5 苦荞麦蛋白质（BWP）酶解[6]

称取一定量苦荞麦蛋白质，使底物浓度为3%，充分溶解后取母液10 mL备用，调节蛋白质溶解液温度为 35℃，pH9.0，加入碱性蛋白酶 2 000 U，酶解 3 h，每隔30分钟取一次酶解液备用于后续研究。

2.6 水解度测定

蛋白质水解度（DH）代表蛋白质在水解过程中，肽键被裂解的程度或百分比，计算公式为DH=h/htot。常用的测定方法有pHstate法、茚三酮比色法、硝基苯磺酸法等。本文参考徐英操等[7]蛋白质水解度测定方法中的茚三酮比色法，并在此基础上稍作改进。

2.7 不同水解度酶解液抗氧化能力测定

2.7.1 总抗氧化能力测定

按照总抗氧化能力试剂盒试剂盒说明书操作。

2.7.2 超氧阴离子自由基清除能力测定

采用邻苯三酚自氧化法对不同水解度的苦荞蛋白酶解液的超氧阴离子自由基清除能力进行测定。在比色中加入1 mL浓度为5 mg/mL的不同水解度的苦荞蛋白水解液，再加入1.5 mL Tris-HCl缓冲液，0.5 mL邻苯三酚溶液，迅速混合，开始计时，每隔30s读数一次，至300 s时为止。空白对照液中加入1 mL Tris-HCl缓冲液代替待测样品溶液。以蒸馏水为参照液，在325 nm条件下测吸光度。计算公式为：

2.7.3 羟自由基清除能力测定

参照李志英等[8]的研究方法，并在此基础上稍作改进。在试管中加入2 mL 9.0 mmol/L硫酸亚铁铵和2 mL 9.0 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，然后分别加入浓度为5 mg/mL的不同水解度的苦荞蛋白水解液2 mL，最后加入2 mL 8.8 mmol/L过氧化氢启动反应。空白对照液中加入2 mL蒸馏水代替同体积的苦荞蛋白水解液，在37℃条件下保温0.5 h后，以蒸馏水为参照液，在510 nm波长处测定吸光度。计算公式：清除率/%=（A0-AS）/A0×100，式中：A0为空白试样吸光度值；AS为待测试样吸光度值。

2.7.4 DPPH自由基清除能力测定

参照Se-Kwon[9]等、Suda[10]等关于DPPH自由基清除率的研究方法，并在此基础上稍作改进。在试管中加入1.5 mL含0.1 mmoL/L DPPH的95%乙醇，1 mL不同水解度的苦荞麦蛋白酶解液，混合振荡，在室温下放置30 min，然后在波长517 nm处测定吸光度。以1.5 mL 95%乙醇加入1 mL蒸馏水调零做空白对照。计算公式为：

式中：Ac为1.5 mL DPPH溶液加入1.5 mL蒸馏水在517 nm处吸光值；Ai为1 mL样品液加入1.5 mL DPPH在517 nm处吸光值；Aj为1.5 mL样品液加入1.5 mL 95%乙醇在517 nm处吸光值。

3 结果与讨论

3.1 原材料中的蛋白质含量测定

根据蛋白质含量的测定方法操作。原材料经试样消解，最终测得原材料中的蛋白质含量为13.04%。

3.2 黄酮化合物去除效果

正己烷萃取苦荞麦蛋白复合物3次后，用Mg-HCl法检测黄酮类化合物，结果显示，反应液不呈现粉红色，说明苦荞麦蛋白中不含黄酮类化合物，或含量甚微不足以影响实验研究。

3.3 料液比、提取时间、提取温度、pH值对苦荞麦蛋白质提取率的影响

表1中记录的试验数据运用响应面进行分析可知，在各因素所选的实验条件下，变量之间的相互关系可用以下统计学模型表示：

式中：Y为提取率，%；A为提取时间，h；B为提取温度，℃；C为pH值；D为料液比，g/mL。

表2分析了该模型的可信度，包括失拟项、信噪比、残差、P值、F值等。模型的P值是显著的（P＜0.01），“失拟项”值是不显著的（P＞0.05），F 值为 4.56，且Prob＞F值为0.38%，说明该模型是显著的，仅有0.38%的几率模型会受到外界环境的干扰，这些指标都指示提取率设计的实验模型具有很好的可信度。R2为0.820 2，意味着模型优化值与实验真实值之间具有很好的拟合度，可采纳。

图1（a-f）显示了各因素之间的交互作用，单因素B，C，及交互项AB、AD、BD，B2是显著的，对苦荞麦蛋白质提取率具有正增加效应。其中温度具有最显著的影响效果，它的变化会比其他因素更强的影响蛋白质提取率。因此我们将蛋白质提取的最佳提取条件优化为提取时间 50 min，料液比 1 ∶12（g/mL），提取温度55℃，pH 10.0。在该条件下提取的BWEP中蛋白质的含量为85%。

图1 因素交互作用图Fig.1 Impact factor intercrossing figure

3.4 水解度测定结果

图2是以预测组分的标准品甘氨酸含量为横坐标，该物质在570 nm处的吸光度为纵坐标绘制的标准曲线，该曲线反映了了-NH2含量与吸光度值之间的关系，曲线R2为0.998 2，模型显著，说明两者之间具有很好的线性拟合关系，可以用作水解液水解度的测定。

图2 水解度标准曲线Fig.2 Standard curve of DH

图3是通过标准曲线和数学表达式计算的不同时间段各酶解液的水解度，图3显示，随着时间的延长，-NH2不断被酶水解下来，水解度不断变大。但刚开始水解度增加的速度比较快，逐渐减慢，这是由于随着时间的推移，底物逐渐完全与酶结合，达到饱和状态而逐渐趋于平稳。

图3 不同时间段水解度测定Fig.3 DH of different time

3.5 不同水解度酶解液的抗氧化能力测定

3.5.1 总抗氧化能力测定

图4是利用总抗氧化能力试剂盒计算的各不同水解时间段下酶解液的总抗氧化能力，结果显示不同水解度的酶解液都具有抗氧化能力，但水解度与抗氧化能力不成正相关。在60 min和90 min时具有较高的总抗氧化能力。这可能是由于水解液中不同分子量组分的组成不同导致的，而在这两个时间段的水解液中具有更多的抗氧化活性强的组成成分，我们将在后续研究中进一步纯化，分析抗氧化能力强的酶解液的组成成分，分子量大小等。

图4 总抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant

3.5.2 超氧阴离子自由基清除能力

图5（a）是采用邻苯三酚法测得的不同水解度条件下各酶解液的超氧阴离子清除能力，结果显示不同酶解液均具有很高的超氧阴离子清除能力，可以进一步分离纯化筛选作为天然抗氧化剂，应用于易产生超氧阴离子的食品中。

3.5.3 羟自由基清除率

图5 自由基清除率Fig.5 Free radical scavenging rate

图5（c）是不同水解度条件下各酶解液的·OH清除能力，结果显示各酶解液几乎不具·OH清除能力，这可能与测试用酶解液的浓度有关，也可能苦荞蛋白酶解液几乎不具有针对羟自由基的清除能力，有待于后续研究。

3.5.4 DPPH自由基清除能力

图5（b）是不同水解度条件下各酶解液的DPPH·清除能力，结果显示不同水解度的酶解液均具有DPPH自由基清除能力，但120 min时，酶解液具有很高的清除活性，这与水解液中的生物活性成分有关，具有很多的能与自由基配对的单电子，从而表现出很高的生物活性。

4 结论

苦荞麦原料中的蛋白质含量为13.04%，通过碱提酸沉法提取的蛋白质粗提物中的蛋白质含量为85%。响应面软件优化的提取蛋白质的最大提取工艺为：提取时间50 min，提取温度55℃，pH为10.0，料液比为1∶12（g/mL）。苦荞麦生物活性肽具有很强的总抗氧化能力和很好的超氧阴离子、DPPH自由基清除能力。我们将在后续研究中对抗氧化能力强的水解液进行分离纯化获得一定分子量大小的高活性生物活性肽，或针对某一自由基清除能力高的酶解液分离纯化应用于天然抗氧化剂，并继续探讨苦荞麦生物活性肽的其他功能，如降血压、抗疲劳、降血脂等。

[1]张超.苦荞麦蛋白质抗疲劳功能的研究[D].无锡：江南大学,2004：1-2

[2]崔霞,武云娜,李欣.苦荞麦活性肽的研究现状及发展趋势[J].农业技术与装备,2012(9)：71-72

[3]中华人民共和国卫生部.GB5009.5-2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社2010：1-3

[4]王孝平,刑树礼.考马斯亮蓝法测蛋白质含量的研究[J].天津化工,2009,23(3)：40-41

[5]陈云中,周享春.苦荞麦黄酮提取最佳条件的研究[J].广州食品科技,1999,15(3)：29-31

[6]崔霞,周艳明,牛森.酶法水解苦荞蛋白制备可溶性生物活性肽最佳条件的研究[J].食品科技,2006,13(1)：39-41

[7]徐英操,张春红.蛋白质水解度测定方法综述[J].食品研究与开发,2007,28(7)：173-175

[8]李志英,张海荣,梁慧艳.5种葡萄酒清除羟自由基的比较[J].酿酒科技,2006(4)：26-28

[9]Se-Kwon K,W Isuru,Y P Eun,et al.Proteins and Peptides as Antioxidants[M]//Bioactive Food Proteins and Peptides.Boca Raton：CRC Press Inc,2011：97-116

[10]Suda,Shinohara,Suzuki,et al.Antioxidative Activity[M]//The Methods of Food Functions Analysis.British：British library CAS,2000：218-220

Antioxidant Activity of Fagopyrum tataricum Enzymolysis Product

CHEN Hua，ZHAN Hai-yue*，WANG Peng
（College of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

Fagopyrum tataricum was used as raw material，then using alkali extraction and acid precipitation method to extract protein complex，using the single factor experiment and response surface software to optimize the best protein extraction technology，the optimization results was extracting time 50 min，olid-liquid ratio 1∶12（g/mL），extraction temperature 55℃，pH 10.0.Removed the flavonoids and lipids in tartary buckwheat protein by n-hexane.Then，hydrolyzed tartary buckwheat protein into polypeptide solution by alkaline protease.So we can research on the total antioxidant capacity，superoxide anion radical，hydroxyl free radical and DPPH radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate with different degree of hydrolysis.The result showed that the enzymatic hydrolysates above，all had antioxidant ability.But they had the different radical scavenging activity，the best was followed by DPPH·and nearly had no·OH scavenging activity.

Fagopyrum tataricum protein；response surface analysis；enzymolysis product；antioxidant activity

2017-05-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.004

陈花（1989—），女（汉），研究生，硕士，研究方向：天然产物提取。

*通信作者