黄曲霉毒素免疫亲和柱性能评价方法及应用

徐文远，倪新，崔淑华，朱万燕

（1.临沂出入境检验检疫局，山东临沂276034；2.山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心，山东青岛266002）

黄曲霉毒素免疫亲和柱性能评价方法及应用

徐文远1，倪新1，崔淑华2，朱万燕1

（1.临沂出入境检验检疫局，山东临沂276034；2.山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心，山东青岛266002）

探索建立一种简便可靠的黄曲霉毒素免疫亲和柱性能评价方法并利用该方法对国内市场上5个主流品牌产品进行对比评价。依据评价结果进行产品采购使用，经3年多实用经验证明了方法的可靠性。该性能评价方法不仅能够从确保检测质量和降低检测成本两方面指导亲和柱的采购还能够协助倒逼生产商不断提升产品质量。

黄曲霉毒素；免疫亲和柱；性能评价；对比评价

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一类结构和理化性 质相似的真菌次级代谢物，具有强致癌性和免疫抑制性[1-3]。该类毒素广泛存在于花生及其制品、玉米及其制品、乳与乳制品、动物饲料、棉花籽、杏仁、开心果等食品中，黄曲霉毒素不仅直接对人体及动物造成毒害，还可以通过食物链从动物体转内移到人体内造成二次危害[4-5]。从环节上控制黄曲霉毒素污染有一定的难度，从源头上消除目前技术尚未成熟，提高检测技术水平加强对该类产品的监测监管是当务之急。

黄曲霉毒素的检测方法有多种，主要有薄层层析法、快速微柱法、酶联免疫法、电化学免疫传感器法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等。薄层层析法灵敏度、精密度和重现性较差，微柱法定量差，酶联免疫法假阳性率较高[6]。免疫亲和净化液相色谱法及液相色谱串联质谱法是当前黄曲霉毒素的主要检测方法，液相色谱串联质谱法无论在定性还是定量上均具有其他方法无法比拟的优势，但其高昂的仪器价格限制了其广泛应用。

免疫亲和柱净化-高效液相色谱法（IAC-HPLC）是当前最为简洁、准确、快速和常用的黄曲霉检测方法[7]。免疫亲和柱是该类检测方法的主要耗材，其性能的好坏和成本的高低直接关系到检测结果的准确性和检测成本。免疫亲和柱性能评价方法对于筛选出性能优越的亲和柱，提高检测结果准确性具有重要意义。为此我们根据黄曲霉毒素检测用免疫亲和柱产品特点探索建立了一种快速简洁的性能评价方法。基于自行建立的方法对目前市场上国内外5个主流品牌产品性能进行了对比评价活动。性能评价方法主要从添加回收率、批内差、批间差、准确度、稳定性和柱容量等产品关键技术指标进行评价。

1 免疫亲和柱对比验证方案

1.1 样品筛选

依据GB/T 18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法》（液相色谱法）对多批次花生样品进行检测，筛选出阴、阳性样品。

1.2 添加回收试验

在阴性样品中添加标准品至浓度分别为2、5、10 μg/kg，按 GB/T 18979-2003（液相色谱法）检测，样品前处理参考各个厂家亲和柱说明书进行操作。检测各个浓度下B1、B2、G1、G2各个组分含量并计算回收率。

回收率/%=洗脱量/上样量×100。

检测数量：单一批次亲和柱检测数量随机抽取不低于18支。

批内差、批间差检测。变异系数=方差/均值×100。评价不少于2批产品，批次间隔不少于2个月，每批至少18根。

1.3 准确度

采样标准样品，按GB/T 18979-2003（液相色谱法）方法进行操作。

准确度/%=检测量/实际量×100，采取双平行试验方法。

1.4 稳定性

将产品放置于冷藏柜内（控温4℃），每2周随机抽取3支进行添加回收试验，根据回收率对产品稳定性进行考评。

1.5 柱容量

一次添加超量的AFT标准品、采用高浓度标准样品或天然阳性样品，测定回收率。

2 试验部分

2.1 主要仪器

Agilent 1200液相色谱仪、G1321A荧光检测器：安捷伦科技有限公司；AURA 230V 8W柱后光化学衍生器：美国AURA公司；德国斯蒂芬UM44A粉碎机：德国斯蒂芬公司；WARINGCOMMERCIAL8010S均质器：美国WARING公司；IKA T25分散机：德国IKA公司。

2.2 材料与试剂

花生仁：国家农产品安全检测重点实验室（临沂）日常检测样品；黄曲霉毒素标准样品：纯度>99%，Sigma公司；乙腈、甲醇（色谱纯）：美国天地公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；提取用水为蒸馏水；液相流动相用水为milli-Q净化超纯水；折叠滤纸、纤维滤纸、玻璃注射器、塑料漏斗和塑料烧杯：中检维康技术有限公司。

2.3 标准品的配制

分别取1 mL浓度为3 μg/mL溶于体积比为2∶98的苯与乙腈的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2标准品于10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，得到浓度为0.3 μg/mL标准储备液。4种标准储备液等体积（各取1 mL）混合得标准工作液。

2.4 样品的提取和净化

称取经粉碎后的花生仁试验样品25.0 g，加5.0 g氯化钠，添加相应体积浓度为0.3 μg/mL的B1、B2、G1、G2标准储备液，放置2 h左右，用体积比70∶30的甲醇与水提取液定容至125 mL，均质提取2 min，用折叠滤纸过滤，移取15 mL滤液加30 mL水稀释，用纤维滤纸过滤后，准确移取15 mL上述滤液，注入玻璃注射器中，以自然流速通过免疫亲和柱，流完后吹入空气进入亲和柱中，然后用10 mL蒸馏水淋洗免疫亲和柱两次，弃去全部流出液，吹干小柱，在小柱加入1 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液于样品瓶中供HPLC测定。

2.5 液相色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（ZORBAX SB-C18 5 μm，250 mm ×4.6 mm）；流速：1.00 mL/min；温度：30℃；进样体积：10 μL；流动相：甲醇 ∶水=45 ∶55（体积比）；检测器：荧光检测器，波长 λEx=360 nm，λEm=440 nm。

3 结果与讨论

3.1 方法的选择

免疫亲和柱净化高效液相色谱法检测花生中黄曲霉毒素，前处理过程对结果的准确性影响较大。提取液的配比和洗涤及淋洗速率是影响检测准确性的关键因素。该对比评价试验所采用的提取液甲醇和水的配比为70∶30（体积比）。对于淋洗速率，GB/T 18979-2003（液相色谱法）方法指出为6 mL/min。实际批量检测操作时用气泵加压，因不同品牌产品填装工艺差异不易控制每个柱子流速在同一水平。基于免疫亲和净化为抗体抗原相互作用过程的原理及实验室日常检测经验数据，淋洗速率减慢能提高检测回收率。本次试验采取亲和柱上样后整个前处理过程不再加外压，完全依靠自然重力净化。考虑到多次添加和提取批次间的差异，本试验采取将同一批验证亲和柱所用多次添加提取液全部混合均匀后再进行检测，以消除提取差异。

3.2 液相色谱仪校正

样品液相色谱检测采用五点即用标准工作液稀释 得到 浓 度 分 别 为 15、7.5、3.75、1.875 ng/mL 和0.937 5 ng/mL校正液。经HPLC检测后相关系数均大于0.995。

3.3 添加样品情况及检测结果

以10 μg/kg浓度添加样品检测过程为例：称取试验样品25.0 g，加5.0 g氯化钠，用浓度为0.3 μg/mL的B1、B2、G1、G2标准储备液混合后氮气吹至1 mL左右添加到样品中，避光静置2 h后用体积比70∶30的甲醇与水的提取液定容至125 mL，均质提取2 min。用折叠滤纸过滤．将4次提取后的过滤液全部混合均匀后加提取液体积2倍的水稀释，用纤维滤纸过滤后，准确移取15 mL上述滤液，注入玻璃注射器中，以自然流速通过免疫亲和柱，流完后吹入空气进入亲和柱中，再用10 mL蒸馏水淋洗免疫亲和柱两次，弃去全部流出液，吹干小柱。在小柱加入1 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液于样品瓶中供HPLC测定。

3.4 10 μg/kg浓度添加的平均回收率及标准偏差

回收率及相对偏差表见表1。

表1 回收率及相对偏差表Table 1 Recovery and RSTD data

3.5 柱容量

柱容量验证试验采用50 μg/kg浓度添加水平样品。经3个平行样品的检测5个品牌亲和柱产品回收率均在73%～113%间，数据表明所验证品牌产品在柱容量方面均能满足日常检测需要。

3.6 讨论

综合试验成本和验证周期，添加回收、批间差和批内差3个指标同时做，即每个品牌的每个批次同时做3个浓度6个平行验证及3个天然阳性样品检测。本次验证过程共进行了 2、5、10 μg/kg 3个浓度的添加，其他两个浓度添加的结论同10 μg/kg浓度添加水平一致。因此在实际验证过程中可以只选择一个浓度值进行验证，即提高效率又降低验证成本。通过试验证明所验证5个品牌，除其中E品牌批间/内差大不易判断外，其他4个品牌质保期内4℃储存条件下的稳定性均较好。

通过试验数据可以看出参加对比验证试验的5个不同品牌亲和柱除C品牌对黄曲霉毒素B2和G2，特别是G2的回收不理想外其他4个品牌均能满足试验要求。C品牌产品生产厂家再将亲和柱进行升级改进后性能也能满足要求。从厂方所提供的两个批次看批间和批内差别均较好，E品牌批次P1的产品对黄曲霉毒素G2检测的标准偏差过大的原因是其中5个平行中的一支亲和柱对G2的回收率为41.33%所致，鉴于此次试验为验证试验故保留此数据。

5种不同品牌的亲和柱性能在前处理过程中表现出的差别不大，相对来说A和C两个品牌产品柱内填料较紧密，过柱过程中流畅性差。B品牌产品过柱时最流畅，另外A和E两个品牌产品的盖子均过紧且E品牌的盖子太小不宜打开。总体技术评价优良降序排序为D、B、A、C和E。基于性能对比验证目的，本次试验采取了统一的前处理方法。统一的方法可能引起结果差异，但食品检测机构的检测活动需要标准依据，在执行相应标准时如GB/T 18979-2003（液相色谱法）测定花生及制品中黄曲霉毒素，需按标准方法要求进行操作。

4 结论

本文所采用的黄曲霉毒素检测用免疫亲和柱对比方法是结合检测实际着重从产品的回收率、批内差、批间差、准确度、稳定性和柱容量等产品关键技术指标考察。该方法简便易行，能够筛选出性能优越产品，保证检测质量。通过几年的实用验证证明该方法完全可行，可信。参加验证试验的5个国内外产品品牌在收到验证报告的同时也收到了一份产品建议，对于企业提高产品质量和技术水平具有重要意义。经过改进提高5种产品性能均能满足日常检测基本需要，总体来说此类产品质量较好。

[1]Thomas W K,Bill D R,Gerald N W,et al.Aflatoxin：A 50-Year Odyssey of Mechanistic and Translational Toxicology[J].Toxicological Sciences,2011,120(S1)：28-48

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[5]刘磊,李小兵,吴殿君,等.黄曲霉毒素免疫学检测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2010(7)：33-36

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[7]María I L,Rebeca R,María T M,et al.Validation of a UHPLC-FLD method for the simultaneous quantification of aflatoxins,ochratoxin A and zearalenone in barley[J].Food Chemistry,2011,127(1)：351-358

Method of Performance Assessment about Aflatoxin Test Immunoaffinity Columns and Its Application

XU Wen-yuan1，NI Xin1，CUI Shu-hua2，ZHU Wan-yan1
（1.Linyi Entry-Exit Inspecting and Quarantine Bureau，Linyi 276034，Shandong，China；2.The Food and Agricultural Products Testing Agency of Shandong Entry-Exit Inspecting And Quarantine Bureau，Qingdao 266002，Shandong，China）

In this article a performance assessment method for aflatoxin test immunoaffinity columns has been developed and applied to five different products.After years of application the method proved to be completely dependable.The performance assessment result which depend on our method can not only been used for product purchase but also as an enhancement to product manufacture for quality improve.

aflatoxin；immunoaffinity column；performance comparison；performance assessment

2016-11-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.032

山东出入境检验检疫局课题（SK201285）

徐文远（1981—），男（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：食品及轻工业品安全检验检测技术。