MNES 对脑损伤后昏迷大鼠PFC 去甲肾上腺素α1 受体表达的影响*

陈 琴，杜 青，冯 珍

(南昌大学第一附属医院康复医学科，南昌 330006)

MNES 对脑损伤后昏迷大鼠PFC 去甲肾上腺素α1 受体表达的影响*

陈 琴，杜 青，冯 珍△

(南昌大学第一附属医院康复医学科，南昌 330006)

目的 探讨正中神经电刺激(MNES)对脑损伤(TBI)后昏迷大鼠的促醒作用及其对前额叶皮质(PFC)去甲肾上腺素α1受体(α1R)表达的影响。方法 将健康成年SD大鼠72只分为对照组、假刺激组、刺激组和拮抗剂组。对照组不做任何处理，其余3组均制作TBI昏迷大鼠模型，假刺激组不做治疗，拮抗剂组大鼠侧脑室注射食欲素受体1(OX1R)拮抗剂SB334867，刺激组和拮抗剂组均给予MNES治疗。观察各组大鼠行为学变化，并应用免疫组织化学技术检测各组大鼠PFC区α1R表达水平。结果 刺激组和拮抗剂组苏醒大鼠分别为13只和8只，而假刺激组仅有4只苏醒。α1R水平从低到高依次为对照组、假刺激组、拮抗剂组、刺激组，并呈依次递增趋势，且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MNES可改善TBI后昏迷大鼠的意识状态水平，其机制可能与上调PFC区α1R表达水平有关，且食欲素A参与调节此过程。

正中神经；电刺激疗法；脑损伤；昏迷；促醒；受体，肾上腺素能α1；食欲素A

近年来，脑损伤(traumatic brain injury，TBI)增长率(21%)远超全球人口的增长率(6%),有“静息性流行病”之称[1]，已成为全球医疗难题。昏迷是TBI的严重并发症之一。我国因TBI所致的长期昏迷患者以10万人/年的速度递增，给国家和患者家庭带来沉重的负担[2]。目前临床上治疗TBI昏迷的方法有[3]：药物治疗、物理治疗、高压氧治疗、中医针灸治疗等。电刺激治疗作为一种物理疗法已应用于临床昏迷患者促醒的治疗[4],常用的电刺激方法包括：颈部脊髓硬膜外刺激(cervical spinal cord stimulation，cSCS)、深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS)和正中神经电刺激(median nerve electrical stimulation，MNES)等。本课题前期研究了MNES对TBI后昏迷大鼠促醒作用与食欲素A(Orexin-A，OXA)及食欲素1型受体(OX1R)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) b受体的关系[5-8]。本研究旨在探讨MNES对TBI后昏迷大鼠的促醒作用及其对前额叶皮质(PFC)区去甲肾上腺素α1受体(α1R)表达的影响，同时探究α1R与OXA及OX1R之间的关系，证实OXA在TBI昏迷促醒中是否起“开关”作用。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：普通级成年SD大鼠72只，体质量250～300 g，由南昌大学医学部动科部提供。适宜条件下饲养1周后开始实验。(2)主要试剂与仪器设备：抗α1-肾上腺素受体(α1-adrenergic receptor，α1-AR)兔多克隆抗体购自英国Abcam公司；OX1R受体拮抗剂(SB334867)由美国Tocris bioscience公司提供；ZS-BS数显脑立体定位仪购自北京众实迪创科技发展有限公司；其他仪器包括：电刺激仪(ES-420)、切片机(RM2015,Leica Germany)等。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模型建立 将72只大鼠分为4组，每组18只。对照组：不做任何处理；假刺激组：造模成功的TBI昏迷大鼠；刺激组：造模成功的TBI大鼠给予MNES治疗；拮抗剂组：造模成功的TBI大鼠侧脑室注射OX1R拮抗剂后给予MNES。使用经典“自由落体撞击法”构建TBI昏迷大鼠模型。乙醚吸入麻醉，取俯卧位，暴露颅顶，立体定位仪定位：中线左侧旁开2 mm、冠状缝前1 mm，用注射器针头十字标记此点为撞击点。待大鼠翻正反射恢复，依据大鼠体质量，将质量400 g圆形铁柱从38～42 cm高度沿垂直金属杆自由下落，撞击颅骨表面撞击点上的薄铝垫片，致颅骨凹陷性骨折，操作完毕，消毒并缝合皮肤。1 h后采用双盲法完成意识状态等级评分。根据大鼠感觉及运动功能情况，将大鼠意识状态分6级，Ⅰ级：在笼内活动如常；Ⅱ级：在笼内活动减少；Ⅲ级：在笼内活动减少并运动失调；Ⅳ级：当背部放在笼的底部时能滚动(翻正反射存在)但不能站立；Ⅴ级：翻正反射消失但对疼痛刺激有肢体回缩反应；Ⅵ级：对任何刺激无反应。将Ⅴ、Ⅵ级评定为昏迷状态纳入实验[9]。实验过程中大鼠意外死亡共8只：假刺激组5只，刺激组1只，拮抗剂组2只，在MNES治疗过程中无大鼠死亡，并重新挑选合格大鼠行相应的处理给予补充。

1.2.2 侧脑室注射OX1R拮抗剂 造模成功的TBI大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)进行麻醉。麻醉起效后，将大鼠取俯卧位，固定于脑立体定位仪上，拆去大鼠头顶部缝合线，暴露颅顶，消毒铺巾。定位于前囟向后1.0 mm，正中线旁开1.5 mm处，用颅骨钻于此处钻孔，切忌误入脑组织。用微量进样器抽取SB334867[10 mg/kg粉末溶解于60∶40二甲基亚砜(DMSO)]约5 μL，固定进样器后垂直进针，颅骨表面往下约4.5 mm，以2.5 μL/min速度泵注，注射完毕留针2～3 min后退针，消毒并缝合头皮。将大鼠放置于恒温加热垫上，观察行为学反应，1 h后给予MNES治疗。

1.2.3 MNES方法 刺激组大鼠在TBI昏迷造模成功后给予MNES治疗；拮抗剂组大鼠TBI造模成功后先行侧脑室注射OX1R，再给予MNES治疗；假刺激组连接MNES仪，但无电流输出。MNES治疗方法：于大鼠右前肢腕部内侧正中，距腕横纹约5 mm处插入1根毫针，齿状接头夹住毫针，连接刺激仪。设置刺激参数：频率30 Hz，脉宽0.5 ms，电流1.0 mA。总治疗时间为15 min，共3个循环。刺激结束后1 h，再次评估意识状态水平，实验完毕，返回笼中，给予充足的食物和水。

1.2.4 实验标本提取与免疫组织化学检测 (1)实验标本提取：每个时间点每组处理大鼠6只，取脑组织标本6个。于实验结束后6、12、24 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.1 g/mL)深度麻醉大鼠，行正中开胸暴露心脏。将成人头皮针(针尖磨平)插入左心室至主动脉弓，剪开右心耳，注入加有肝素钠的灭菌生理盐水约200 mL，直至流出液变清亮，缓慢灌注4%多聚甲醛约200 mL，直到大鼠整个身体僵硬，断头取大脑PFC区。(2)免疫组织化学检测：将脑组织置于4%的水合氯醛溶液内固定12 h，并在PBS液中冷冻保存。脑组织行冠状切片，厚度4 μm，PBS漂洗后用0.3%的过氧化氢液处理30 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温条件下孵育1 h，按1∶500比例滴加抗α1R抗体，4 ℃冰箱过夜，PBS洗涤后再滴加生物素标记的山羊抗兔IgG,室温孵育1 h。最后由有经验的病理实验师在显微镜下观察免疫组织化学实验结果，进行400 倍的显微照相，最后计算出免疫组织化学评分(immunohistochemical score，IHS)。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0 统计软件进行分析，不同组别和时间点的α1R水平以秩均值表示，作Kruskal-Wallis H秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学改变比较 MNES治疗后1 h再次进行意识状态评估，刺激组中13只大鼠出现翻正反射(Ⅲ级8只，Ⅳ级5只)；拮抗剂组中8只大鼠出现翻正反射(Ⅲ级4只，Ⅳ级4只)；假刺激组中4 只出现翻正反射(Ⅳ级4只)。

2.2 各组大鼠免疫组织化学检测 α1R在PFC区神经元细胞膜和细胞质中均有表达(图1)。组间IHS比较：α1R水平从低到高依次为对照组(31.56)、假刺激组(31.78)、拮抗剂组(33.34)和刺激组(48.67)，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验结束后6、12、24 h 3个时间点的α1R的表达水平分别为34.25、35.08、40.17，呈依次递增趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组大鼠PFC区α1R水平表达(×400)

3 讨 论

MNES作为一种外周神经电刺激治疗昏迷的方法，于1996年被日本学者Yokotama首次报道。有研究证实，MNES不仅用于治疗持续植物状态，而且还可用于各种病因所致的意识水平下降的促醒[10-11]。MNES具有非创伤性、无明显并发症、易操作且费用低廉等优点[12]，已广泛应用于临床昏迷患者的促醒治疗。MNES治疗昏迷促醒的临床效果确切，但机制尚未完全明晰。目前认为MNES促醒的可能机制为[10-11,13-15]：激活上行网状激活系统(ascending reticular activating system，ARAS)和觉醒相关核团；增强脑电活动，改善大脑皮质兴奋性；增加大脑皮质血流量灌注，减少神经细胞死亡，促进神经元再生；促进神经营养因子释放，提高大脑神经可塑性；影响大脑神经递质的分泌。正中神经的神经元突触直接参与ARAS活动[13]，ARAS包括3个主要的觉醒系统：胆碱能系统、中缝背核-五羟色胺(5-HT)系统、蓝斑-去甲肾上腺素能系统，其中蓝斑核(locus coeruleus，LC)合成分泌的去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)广泛释放，并支配整个皮质、间脑和大脑的其他区域[16]。而且NE是维持觉醒的重要神经递质之一，通过其兴奋性受体发挥促醒作用。

蓝斑-去甲肾上腺素能系统参与调解睡眠-觉醒。LC合成和释放的NE广泛分布于中枢神经系统，NE包含α1、α2和β受体家族，在众多脑区均有表达。NE通过兴奋性受体α1作用于大脑皮质，维持大脑皮质电生理活动，维持觉醒状态[17]。PFC参与调节觉醒、认知、运动、注意及奖赏等功能。有研究表明，激活大鼠PFC区α1R可提高大鼠觉醒水平，从而改善认知能力[18]。此外，Hilakivi等[19]研究发现α1R拮抗剂可以延长猫的睡眠时间，而α1R激动剂缩短其睡眠时间，维持觉醒状态。因此，推测MNES昏迷促醒作用可能与PFC区α1R表达变化有关。

本实验通过观察大鼠行为学变化，发现刺激组昏迷大鼠18只中有13只清醒，拮抗剂组苏醒8只，假刺激组仅苏醒4只，表明MNES能提高意识状态水平，促进觉醒。此外，通过免疫组织化学检测发现PFC组织中α1R的表达水平呈对照组、假刺激组、拮抗剂组、刺激组依次递增趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，其中刺激组明显高于假刺激组，提示MNES可上调α1R表达水平。由此可说明MNES对TBI后昏迷大鼠具有促醒作用，其作用机制可能与增加PFC区α1R表达有关。假刺激组高于对照组，可能与TBI后应激性脑保护作用相关，以适应机体内外环境的变化。本研究组前期研究结果发现，MNES可以通过上调OXA及其受体OX1R的表达水平从而促进昏迷大鼠觉醒，且OXA在此过程中扮演着重要角色[5-7]。但是OXA是否参与调节α1R的表达，尚并不明晰。本研究中拮抗剂组大鼠经侧脑室注射OX1R拮抗剂SB334867后给予MNES治疗，结果发现：与刺激组相比，拮抗剂组大鼠苏醒只数少，PFC区α1R表达水平也比较低。由此证实了OX1R及其受体OX1R参与MNES促觉醒过程，其机制可能与OX1R上调PFC区α1R表达有关，但其具体分子机制还需进一步研究。6、12、24 h 3个时间点的α1R的表达水平呈依次递增趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与蓝斑-去甲肾上腺素能神经元自身节律相关。当然，本实验需要进一步完善，如延长观察时间；检测其他相关促醒脑区α1R的表达水平。且本实验研究的是单次治疗效果，本课题组将进一步探究MNES的长期疗效以及其相关的分子机制。

综上所述，MNES可以促进TBI后昏迷大鼠意识水平，并上调PFC中α1R表达水平。因此，本研究组推测MNES治疗TBI后意识水平的改善可能与增加PFC区α1R表达有关。上调PFC区α1R表达水平可能是MNES昏迷促醒的机制之一，且OXA参与调节此过程，但是具体的分子机制还有待进一步研究。

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Effect of median nerve electrical stimulation on expression of α1-adrenergic receptor in prefrontal cortex of coma rats induced by traumatic brain injury*

ChenQin,DuQing,FengZhen△

(DepartmentofRehabilitationMedicine,FirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To investigate the wake-promoting action of median nerve electrical stimulation(MNES) in coma rats induced by traumatic brain injury(TBI) and its influence on the expression of α1-adrenergic receptor(α1R) in the prefrontal contex(PFC).Methods Seventy-two healthy Sprague Dawley(SD) rats were randomly divided into the control group,sham-stimulated group(TBI),stimulated group(TBI+MNES) and antagonist group(TBI+OX1R antagonist+MNES).The control group had no any treatment.The TBI coma rat models were prepared in the other 3 groups.The sham stimulated group had no treatment.The antagonist group was injected with orexin receptor-1(OX1R) antagonist SB334867 into lateral ventricle,and both the antagonist group and stimulated group

MNES treatment.Then the behavior changes of rats in each group were observed and the α1R expression level in PFC was detected by using the immunohistochemistry technique.Results Thirteen rats in the stimulated group and 8 rats in the antagonist group revived,while only 4 rats in the TBI group.The α1R levels from low to high were the blank control group,sham-stimulated group,antagonist group and stimulated group,showing the increasing trend,and the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion MNES can improve the rat consciousness level after TBI coma,and its mechanism may be related with up-regulating the α1R expression level in PFC area,moreover Orexin-A participates in this regulation process.

median nerve;electric stimulation therapy;brain injuries;coma;wake-promoting;receptors,adrenergic,alpha-1;Orexin-A

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.002

国家自然科学基金资助项目(81260295)；江西省自然科学基金资助项目(20132BAB205063)。 作者简介：陈琴(1990-)，硕士研究生，主要从事神经康复方向研究。△

，E-mail:fengzhenly@sina.com。

R651.1

A

1671-8348(2017)18-2453-03

2017-02-02

2017-04-06)