膜性肾病患者肾组织M型磷脂酶A2受体1抗原及其抗体的表达差异*

洪国保，赵学峰，吴晓婵，陈健智，罗福漳△

(南方医科大学附属南海医院：1.肾内科；2.检验科；3.病理科，广东佛山 528200)

膜性肾病患者肾组织M型磷脂酶A2受体1抗原及其抗体的表达差异*

洪国保1，赵学峰2，吴晓婵1，陈健智3，罗福漳1△

(南方医科大学附属南海医院：1.肾内科；2.检验科；3.病理科，广东佛山 528200)

目的 探讨肾组织M型磷脂酶A2受体1(PLA2R1)抗原及其抗体在膜性肾病(MN)患者中的表达水平。方法 选取经肾活检证实的特发性MN(IMN)58例、乙型肝炎病毒相关性MN(HBV-MN)15例、V型狼疮性肾炎(V-LN)17例。采用间接免疫荧光法检测肾组织PLA2R1抗原，并与IgG4共定位。同时检测上述MN患者血清抗PLA2R1抗体。分析肾组织PLA2R1抗原及其抗体在MN中的表达差异，以及PLA2R1阳性与阴性患者临床资料的差异。结果 V-LN及HBV-MN患者肾组织及血清中均未发现PLA2R1抗体；在81.03%IMN患者肾组织检测到PLA2R1抗原，70.69% IMN患者血清中检测到PLA2R1抗体，PLA2R1抗原与IgG4共定位，均沿肾小球毛细血管袢呈细颗粒状沉积。PLA2R1抗原阳性患者24 h尿蛋白定量高于阴性患者(P<0.05)，并且血清清蛋白低于阴性患者(P<0.05)。结论 肾组织PLA2R1抗原在IMN的诊断中敏感性及特异性均较高，且表达与临床病情严重性明显相关。

特发性膜性肾病；乙型肝炎病毒相关性膜性肾病；V型狼疮性肾炎；M型磷脂酶A2受体1

膜性肾病(membranous nephropathy,MN)是引起成人肾病综合征(nephrotic syndrome,NS)最常见的病因之一，病理以肾小球上皮下免疫复合物沉积伴基底膜增厚为特点[1-2]。Xu等[3]对我国7万余例肾活检资料统计分析，发现IgA肾病(IgAN)占肾穿刺总数的28.1%，MN占23.4%。MN是继IgAN之后最常见的肾小球肾炎。并且MN是40岁以上人群中最主要的病理类型，推测MN有可能超越IgAN成为我国最主要的肾小球疾病。MN可分为特发性MN(IMN)和继发性MN(SMN)。各国报道IMN比例不同[4-7]，在我国IMN占31.8%。IMN与SMN主要通过详细的病史询问、实验室检查和肾活检病理(包括光镜、免疫病理及电镜)以排除继发因素。Beck等[8]学者于2009年发现M型磷脂酶A2 受体(PLA2R)与IMN的关系，并提出该抗原为IMN的主要靶抗原，在约70%IMN患者血清中发现该抗体，并且提出血清中该抗体及肾组织中该抗原可以用于鉴别IMN与SMN。研究表明，MN患者抗PLA2R1抗体与PLA2R1抗原的表达存在差异，需要在不同地区、不同种族人中验证。在SMN中是否有PLA2R1抗原的表达及该抗原的表达与临床指标的关系均未形成定论。本研究拟使用本院肾活检证实的MN患者90例临床资料进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月至2016年5月在本院经肾活检确诊的MN患者90例，其中IMN患者58例，乙型肝炎病毒相关性MN(HBV-MN)患者15例，V型狼疮性肾炎(V-LN)患者17例。IMN的诊断是根据经肾活检病理检查诊断为MN，通过病史、检验排除SMN。本研究所纳入的病例均未长期使用免疫抑制剂或(和)激素治疗，所有肾穿刺活检均经患者及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 (1)肾组织标本：B超声引导下行肾活检，常规行光镜、免疫荧光和电镜检查。使用石蜡包埋组织采用间接免疫荧光法检测IMN、SMN肾组织PLA2R1抗原。(2)收集患者的血清：留取患者治疗前空腹静脉血，置于促凝剂试管中，3 000 r/min离心8 min，分离血清。

1.2.2 肾组织免疫荧光法检测PLA2R1抗原及IgG4共定位 (1)切片，烤片；(2)脱蜡：二甲苯；(3)复水：梯度乙醇；(4)抗原修复：蛋白酶K 37 ℃孵育30 min，PBS冲洗；(5)一抗：兔抗人PLA2R1多克隆抗体(Sigma-Aldrich)，37 ℃孵育1.5 h，PBS冲洗；(6)二抗：鼠抗兔IgG(abcam)，37 ℃孵育1.0 h，PBS冲洗；(7)加IgG4抗体(Dylight405标记，Jackson)，37 ℃孵育1.0 h；(8)封片，荧光显微镜下观察，共聚焦显微镜下拍摄。

1.2.3 间接免疫法检测IMN患者血清抗PLA2R1抗体 采用欧盟检测试剂盒FA1254-1005-50 IgG。(1)样本准备： PBST 1∶10稀释；(2)加样：加30 μL至反应区；(3)室温下放置30 min，PBST冲洗载片；(4)加样：混匀FITC标记的二抗，滴加25 μL荧光二抗；(5)避光室温温育30 min，PBST冲洗载片；(6)封片荧光显微镜下观察。

1.2.4 观察指标 年龄、性别、血肌酐、血清清蛋白、24 h尿蛋白定量。

2 结 果

2.1 各组患者一般资料比较 3组患者的年龄、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白、血肌酐比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，仅性别比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.2 IMN及SMN患者肾组织PLA2R1抗原阳性率比较 在58例IMN患者中，81.03%(47/58)IMN患者肾组织检测到PLA2R1抗原 。PLA2R1(绿色，图1A)与IgG4(蓝色，图1B)共定位(图1C)，均沿肾小球毛细血管袢呈颗粒状沉积。其中11例IMN患者肾组织中并未发现PLA2R1的沉积。在SMN(V-LN及HBV-MN)肾组织中均未发现PLA2R1抗原的沉积，见图2。

表1 不同病理类型患者的临床特征比较

2.3 IMN患者肾组织PLA2R1阳性与阴性临床资料比较 肾组织抗原阳性与阴性患者在年龄、性别、血肌酐方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。PLA2R1抗原阳性患者24 h尿蛋白定量高于阴性患者(P<0.05)，并且阳性患者血清清蛋白低于阴性患者(P<0.05)，见表2。

表2 IMN肾组织PLA2R1阳性与阴性患者临床资料比较

A：PLA2R1；B：IgG4；C：PLA2R1与IgG4共定位图片。

图1 IMN患者肾组织PLA2R1抗原与IgG4免疫荧光阳性图片(×400)

A：IMN患者；B：HBV-MN患者；C：V-LN患者。

图2 肾组织PLA2R1抗原免疫荧光阴性图片(×400)

A：IMN患者抗体阳性；B：IMN患者抗体阴性；C：HBV-MN患者抗体阴性； D：V-LN患者抗体阴性。

图3 MN患者血清抗PLA2R1抗体间接免疫荧光图片(×400)

2.4 肾组织PLA2R1抗原与血清抗PLA2R1抗体阳性率比较 收集90例MN患者肾活检时空腹血清，检测血清中抗PLA2R1抗体。在HBV-MN及V-LN患者中均未发现抗PLA2R1抗体，在58例IMN患者中有41例检测出该抗体，阳性率为70.69%。在58例IMN患者肾组织及血清均发现PLA2R1者36例；肾组织PLA2R1抗原阴性，并且血清抗PLA2R1抗体阳性者5例；肾组织抗原阳性，血清抗体阴性者11例；两者均阴性者6例。MN患者血清抗PLA2R1抗体间接免疫荧光图片，见图3。

3 讨 论

本研究检测MN患者肾组织PLA2R1抗原及血清抗PLA2R1抗体，结果提示在IMN患者肾组织及血清中其阳性率分别为81.03%、70.69%。肾组织PLA2R1抗原与IgG4共定位。肾组织PLA2R1抗原阳性者24 h尿蛋白高于阴性者，并且血清清蛋白低于阴性者。此外，在32例SMN(15例HBV-MN及17例V-LN)患者肾组织中均未发现PLA2R1抗原，并且在这些患者血清中均未发现该抗体。

Beck等[8]首次提出PLA2R1为IMN的主要靶抗原。此后PLA2R1在IMN患者肾组织及血清中的表达受到了越来越多的关注。后续研究表明不同种族及地区PLA2R1的表达阳性率不一致。Debiec等[9]研究表明,PLA2R1抗原及该抗体阳性率分别为74%、57%。Svobodova等[10]研究表明，PLA2R1抗原及该抗体，阳性率分别为69%、65%。Qin等[11]检测血清抗PLA2R1抗体，阳性率为81.6%。祝爽爽等[12]检测肾组织PLA2R1抗原阳性率为85.37%。周广宇等[13]检测IMN患者血清抗PLA2R1抗体，阳性率为75%。本研究结果在IMN患者肾组织及血清中其阳性率分别为81.03%、70.69%。本研究提示肾组织PLA2R1抗原敏感性高于血清该抗体敏感性，并且高于国外所报道阳性率。提示国内IMN患者PLA2R1介导者较多。

本研究并未在所有IMN患者肾组织中检测到PLA2R1抗原，分析原因可能为：(1)其他的抗原参与IMN的发病(如人Ⅰ型血小板域蛋白7A[14])；(2)在肾活检时患者虽然临床表现为NS，但是不处于免疫活动期，所以PLA2R1抗原没有被检测出[8]；(3)虽然有些患者病理表现为MN，电镜未见多部位电子致密物沉积、血清学检查及临床资料均未发现继发因素，但不能完全排除SMN的可能。

关于肾活检时PLA2R1抗原表达与临床资料的关系仍有争议。Xun等[15]分析血清抗PLA2R1抗体阳性患者与阴性患者肾活检时临床资料，发现该抗体阳性患者24 h尿蛋白明显高于阴性患者。Svobodova等[10]研究结果提示，肾组织该抗原阳性者与阴性者肾活检时两组在血肌酐、24 h尿蛋白定量、血清清蛋白水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。周广宇等[13]结果提示，IMN患者PLA2R1抗体阳性者24 h尿蛋白定量高于抗体阴性患者。祝爽爽等[12]研究结果提示，肾组织PLA2R1阳性患者与阴性患者在肾活检时血肌酐、血清清蛋白、24 h尿蛋白定量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究结果与文献[13,15]一致，与祝爽爽等[12]研究结果不同。分析原因可能为祝爽爽等[12]研究中IMN肾组织PLA2R1抗原阴性者病例数较少仅6例，若其扩大样本可能会得出不一致结果。本研究结果提示肾组织PLA2R1抗原阳性者肾活检时24 h尿蛋白定量高于阴性者，血清清蛋白低于肾组织PLA2R1抗原阴性者。提示肾组织PLA2R1抗原阳性者病情更严重。

PLA2R1是一种相对分子质量为180×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其参与MN的机制尚未被完全理解[16-17]。PLA2R1抗原参与MN发病的机制及该抗原能否用于治疗MN，在后续工作中有必要继续研究。

综上所述，肾组织PLA2R1抗原在诊断IMN的诊断中敏感性及特异性较高，且肾活检时肾组织PLA2R1抗原表达与临床病情严重性明显相关。

[1]Lai WL,Yeh TH,Chen PM,et al.Membranous nephropathy:a review on the pathogenesis,diagnosis,and treatment[J].J Formos Med Assoc,2015,114(2):102-111.

[2]Ronco P,Debiec H.Anti-phospholipase A2 receptor antibodies and the pathogenesis of membranous nephropathy[J].Nephron Clin Pract,2014,128(3/4):232-237.

[3]Xu X,Wang G,Chen N,et al.Long-Term exposure to air pollution and increased risk of membranous nephropathy in China[J].J Am Soc Nephrol,2016,27(12):3739.

[4]Zeng CH,Chen HM,Wang RS,et al.Etiology and clinical characteristics of membranous nephropathy in Chinese patients[J].Am J Kidney Dis,2008,52(4):691-698.

[5]Cahen R,Francois B,Trolliet P,et al.Aetiology of membranous glomerulonephritis:a prospective study of 82 adult patients[J].Nephrol Dial Transplant,1989,4(3):172-180.

[6]Abe S,Amagasaki Y,Konishi K,et al.Idiopathic membranous glomerulonephritis:aspects of geographical differences[J].J Clin Pathol,1986,39(11):1193-1198.

[7]Honkanen E.Survival in idiopathicmembranous glomerulonephritis[J].Clin Nephrol,1986,25(3):122-128.

[8]Beck LH,Bonegio RG,Lambeau G,et al.M-type phospholipase A2 receptor as target antigen in idiopathic membranous nephropathy[J].N Engl J Med,2009,361(1):11-21.

[9]Debiec H,Ronco P.PLA2R autoantibodies and PLA2R glomerular deposits in membranous nephropathy[J].N Engl J Med,2011,364(7):689-690.

[10]Svobodova B,Honsova E,Ronco P,et al.Kidney biopsy is a sensitive tool for retrospective diagnosis of PLA2R-related membranous nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(7):1839-1844.

[11]Qin W,Beck LH,Zeng C,et al.Anti-phospholipase A2 receptor antibody in membranous nephropathy[J].J Am Soc Nephrol,2011,22(6):1137-1143.

[12]祝爽爽，周树录，周朝敏，等．成人特发性膜性肾病肾组织M型磷脂酶A2受体1抗原的检测[J]．南方医科大学学报，2015(4)：526-529．

[13] 周广宇,金玲,于晶,等.成人膜性肾病患者血清抗PLA2R抗体与病情的相关性[J].中华肾脏病杂志，2012,28(2):111-114.

[14]Tomas NM,Beck LH,Meyer-Schwesinger C,et al.Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy[J].N Engl J Med,2014,371(24):2277-2287.

[15]Xun C,Shuai L,Wang W,et al.Comparison of biomarkers between PLA2RAb+ and PLA2RAb- in patients with idiopathic membranous nephropathy[J].Int Urol Nephrol,2015,47(5):831-835.

[16]Floege J,Amann K.Primary glomerulonephritides[J].Lancet,2016,387(132):2036-2048.

[17]Ronco P,Debiec H.Pathophysiological advances in membranous nephropathy:time for a shift in patient′s care[J].Lancet,2015,385(9981):1983-1992.

医学统计工作的基本内容

按工作性质及其先后顺序，可将医学统计工作分为实验设计、收集资料、整理资料、分析资料。实验设计是开展某项医学研究工作的关键，包括医学专业设计和统计学设计，医学专业设计的内容包括研究对象纳入和排除标准、样本含量、获取样本的方法、分组原则、观察(检测)指标、统计方法等。收集资料的方法包括各种试验、检测或调查，要求资料完整、准确、及时、有足够数量、具有代表性和可比性等。整理资料包括原始资料的检查与核对、对资料进行分组与汇总等。分析资料即对资料进行统计学分析，包括进行统计描述和统计推断。

Expression difference of renal tissue M-type phospholipase A2 receptor 1 antigen and its antibody in patients with membranous nephropathy*

HongGuobao1,ZhaoXuefeng2,WuXiaochan1,ChenJianzhi3,LuoFuzhang1△

(1.DepartmentofNephrology;2.DepartmentofClinicalLaboratory;3.DepartmentofPathology,AffiliatedNanhaiHospitalofSouthMedicalUniversity,Foshan,Guangdong528200,China)

Objective To detect the expression levels of renal tissue M-type phospholipase A2 receptor 1(PLA2R1) antigen and its antibody in the patients with membranous nephropathy(MN).Methods Fifty-eight cases of biopsy-proved idiopathic membranous nephropathy(IMN),fifteen cases of hepatitis B-associated membranous nephropathy(HBV-MN) and seventeen cases of V type lupus nephritis(V-LN) were selected.Renal tissue PLA2R1 antigen was detected by indirect immunofluorescence and colocaliazed with IgG4.Serum anti-PLA2R1 antibody was simultaneously examined.The expression difference of PLA2R1 antigen and anti-PLA2R1 antibody in MN was analyzed.And the differences of clinical data were analyzed between PLA2R1 positive and negative patients.Results The PLA2R1 antibody was not found in the renal tissue and serum of the patients with LN and HBV-MN;PLA2R1 antigen was found in 81.03% of IMN patients,and its antibody was found in serum of 70.69% of IMN patients.PLA2R1 antigen and IgG4 co-localization all deposited along glomerular capillary loop presenting as fine granules.The 24 h urine protein level in the patients with PLA2R1 antigen deposition in renal tissues was higher than that in the patients without PLA2R1 deposition (P<0.05),moreover serum albumin level was lower than that in the patients without PLA2R1 deposition(P<0.05).Conclusion The sensitivity and specificity of renal tissue PLA2R1 antigen in the diagnosis of IMN are higher.The expression of PLA2R1 antigen in renal tissue by biopsy is significantly correlated with the clinical severity.

idiopathic membranous nephropathy;hepatitis B virus associated membranous nephropathy;V lupus nephritis;M-type phospholipase A2 receptor 1

佛山市卫生和计划生育委员会医学科研课题( 20160213)。作者简介：洪国保(1982—)，主治医师，在读博士研究生，主要从事肾小球疾病临床及病理研究。△

，E-mail:luo1844@126.com。

0.3969/j.issn.1671-8348.2017.18.006

R692.3+1

A

1671-8348(2017)18-2461-03

2017-01-17

2017-03-16)