一株烟碱降解菌的筛选、保存及其降解性能

殷全玉, 张玉兰, 许希希, 陆霜, 李梦匣, 郭凤清, 刘国顺

(河南农业大学 烟草学院, 河南 郑州, 450002)

一株烟碱降解菌的筛选、保存及其降解性能

殷全玉, 张玉兰, 许希希, 陆霜, 李梦匣, 郭凤清, 刘国顺

(河南农业大学 烟草学院, 河南 郑州, 450002)

为了探究不同培养基保存方式、不同培养液条件下烟碱降解菌的降解性能, 以烟碱为唯一碳源和氮源,从河南农业大学许昌校区现代烟草农业科教园区植烟土壤、腐烂烟叶中分离得到25株烟碱降解菌(耐受烟碱浓度为6 g/L), 并选择降解效率较高的几株作为继续研究对象。研究表明: 用烟碱作为唯一碳源和氮源的培养基(烟碱浓度2～3 g/L)斜面保存的菌株降烟碱活性较高; 筛选得到一株烟碱高效降解菌5A-6-2, 在其它碳、氮源同时存在时, 仍然具有较强的烟碱降解能力; 将5A-6-2接种至固体烟叶碎片中, 28 ℃发酵7 d后, 烟叶中烟碱含量下降了44.2%; 通过16S rDNA序列分析发现, 其与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)同源性为99%。

烟碱降解菌; 筛选; 保存; 降解特性

烟碱(Nicotine)又称尼古丁, 占烟草生物碱的95%以上, 是影响烟草品质的重要因素之一[1]。我国部分烤烟烟叶烟碱含量较高, 尤其是上部烟叶, 白肋烟的烟碱含量甚至高达6.0%, 高烟碱烟叶可用性较差[2]。中国卷烟产量世界第一, 每年产生的烟草废弃物约100万t。这些废弃物如果不加处理就直接投放到环境中, 会造成土壤和地下水的严重污染, 破坏生态安全, 危害人类的健康[3]。如果将这些废物合理利用, 将会是一笔巨大的财富, 同时能够减轻环境的压力。大量研究表明, 利用微生物降解烟碱, 在提高烟叶品质、降低烟草危害、保护环境和提高烟草资源利用率等方面具有重要意义和发展前景, 是目前烟草研究的一个热点[4–5]。国内外已发现的可降解烟碱的细菌主要有节杆菌属(Arthrobacternicotinoborans)、假单胞菌属(Pseudomonassp.No.4)、纤维单胞菌属(Cellulomonassp)和苍白杆菌属(Ochrobactrumintermedium)等多个属不同种的细菌菌株[6–8]。龙章德等[9]从广西都安县地区的土壤中分离得到一株能高效降解烟碱的菌株D9, 其烟碱降解率为82%, 耐受烟碱的最高浓度为8 g/L。任平等[10]从植烟土壤和烟叶上分离得到一株强降解烟碱的菌株Y523, 其烟碱降解率为63.8%。

本研究从多年植烟土壤、腐烂烟叶中分离得到能够降解烟碱的菌株, 并对菌株降解烟碱的能力进行测试, 对菌株进行初步鉴定, 为进一步研究应用奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 菌种与试剂

采集河南农业大学烟草学院许昌试验园区多年植烟区土壤样品3份, 烟叶堆肥3份, 从中筛选烟碱降解菌。

主要试剂包括胰蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉、烟碱(≥99%)、琼脂、HCl(36%～38%)、NaCl(分析纯, 下同)、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCl2、CuCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、NaOH。

1.2 主要仪器和设备

LRH-150B生化培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)、HCY-CA恒温摇瓶柜(太仓市豪成实验仪器制造有限公司)、ZZSY-2150电热鼓风干燥箱(郑州市生元仪器有限公司)、FA2004B电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、T6新世纪的紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)和JW-1016低速离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)。

1.3 培养基

LB培养基[1]: 酵母膏5.0 g/L, 胰蛋白胨10.0 g/L, 氯化钠5.0 g/L, pH7.0。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。固体培养基中添加2.0%琼脂。

LB-烟碱培养基[1]: 酵母膏5.0 g/L, 胰蛋白胨10.0 g/L, 氯化钠5.0 g/L, 99%烟碱2 g/L, pH7.0。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后, 烟碱用0.22 µm滤膜过滤除菌后根据需要在灭菌后加入。固体培养基中添加2.0%琼脂。

烟碱降解菌选择培养基(YJ培养基)[1]: K2HPO4·3H2O 17.4 g/L, KH2PO44.0 g/L, (NH4)2SO40.1 g/L,酵母浸粉1.0 g/L, 99%烟碱3 g/L, 微量元素溶液10.0 mL/L, PH7.0。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后, 烟碱用0.22 µm滤膜过滤除菌后根据需要加入。

微量元素溶液: 称取MgSO4·7H2O 1.0 g, MnSO4·H2O 0.4 g, CaCl20.15 g, CuCl2·2H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.02 g, 用0.1 mol/LHCl溶液溶解定容至100 mL。

2 实验方法

2.1 烟碱降解菌的初步筛选[10]

分别取土壤及堆肥样品1.0 g, 加入9 mL 0.9%生理盐水, 配成浊液, 充分振荡混匀, 自然沉淀一段时间, 取上部较澄清液体, 得到10-1倍稀释液; 取10-1倍稀释液1.0 mL, 溶于9 mL 0.9%生理盐水中, 得到10-2倍稀释液; 以此类推, 配制10-3～10-5不同浓度梯度稀释液。

取10-1～10-5稀释菌液各50 µL, 涂布在烟碱烟碱降解菌选择固体培养基(烟碱浓度2 000 mg/L)中,28 ℃恒温培养3～4 d, 挑选出生长较多、较大的单菌落分离纯化。

采用逐步提高选择培养基中烟碱含量的方法进行高浓度烟碱降解菌的筛选, 烟碱浓度分别为2、3、4、5和6 g/L, 28 ℃恒温培养, 并观察分离株的生长状况。

2.2 复筛

初步得到多种耐受高浓度烟碱(6 g/L)且以烟碱为唯一碳源的菌株, 对其降解烟碱能力进行复筛:将菌株的菌悬液接入烟碱浓度为3 g/L的YJ培养基中, 于37 ℃、180 rpm摇床培养48 h后, 测定培养液中烟碱含量, 根据烟碱降解率的大小复筛菌株。

2.3 培养液中烟碱的定量检测

培养液5000 r/min离心10 min, 上清液用0.05 mol/L盐酸溶液稀释到合适的吸光值范围(0.2～0.8)。以0.05 mol/L盐酸溶液作参比, 分别在236、259和282 nm处测样品吸光值。用99%的纯烟碱作标准曲线, 具体方法为: 用0.05 mol/L盐酸溶液配制不同浓度(0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/L)烟碱溶液, 以0.05 mol/L盐酸溶液做参比, 测定不同烟碱浓度溶液在236、259和282 nm处的吸光值。以此标准曲线来检测培养液中烟碱浓度[1]。

烟碱降解率=(对照烟碱-接菌培养液烟碱)/对照CK烟碱×100%[11]。

2.4 不同培养基保存菌株对其降解性能的影响

挑选降解率较高的几株菌, 分别用LB培养基、YJ2培养基(烟碱浓度为2 g/L的选择培养基)、YJ4培养基(烟碱浓度为4 g/L的选择培养基)斜面划线, 28 ℃恒温培养3～4 d, 制备菌悬液。然后将等量菌悬液接种在烟碱浓度4 g/L的选择液体培养基内, 于37 ℃、180 rpm摇床中培养。以不接菌的空白培养基为对照, 检测48 h培养液中烟碱的含量, 计算烟碱降解率。

2.5 菌株5A-6-2降解性能

2.5.1 不同反应体系中菌株对烟碱的降解效果

用2 g/L的烟碱选择培养基斜面保存菌种, 28 ℃恒温培养3～4 d, 制备菌悬液, 然后将菌悬液分别接种在等量的YJ2液体培养基和LB2(烟碱浓度为2 mg/L的LB培养基)液体培养基中, 于37 ℃、180 rpm摇床中培养48 h, 以不接菌的空白培养基为对照, 检测培养液中烟碱的含量, 计算烟碱降解率。

2.5.2 不同培养基保存菌株降解效果对比

分别用YJ2和LB斜面保存菌种5A-6-2, 28 ℃恒温培养3～4 d, 制备菌悬液, 然后将菌悬液分别接种在LB2液体培养基中, 于37 ℃、180 rpm摇床中培养48 h, 以不接菌的空白培养基为对照, 检测培养液中烟碱的含量, 计算烟碱降解率。

2.5.3 固体烟叶发酵实验

称取20 g调制后烟叶碎片(含水率15%～17%)放入三角瓶中, 实验组加入等量菌悬液(10%比例接菌), 对照组加入等量无菌水, 调节物料水分含量至45%～50%, 纱布封口, 28 ℃发酵7 d后, 取出烟叶,64 ℃烘干、粉碎, 用盐酸提取脱色法测定粉末中烟碱含量。与对照组比较, 计算烟叶烟碱降解率。3次重复, 每次5瓶。

2.6 烟碱降解菌5A-6-2 16S rDNA序列的测定[12]

将菌株于30 ℃180 rpm条件下培养至对数期后，采用细菌16S rDNA的通用引物(正向引物序列 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, 反向引物序列5’-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3’)进行16SrDNA的PCR扩增。

PCR反应体系(50 μL): 模板(菌液)1 μL, 16S L(27F)2 μL, 16S R(1492R)2 μL, 2×Taq Mix酶25 μL, 重蒸水20 μL。

PCR反应条件: 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 循环36次, 72 ℃延伸10 min, 10 ℃保温。

PCR引物由郑州久是生物技术有限责任公司提供，PCR产物的纯化和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。利用BlaLst将测序结果在NCBI基因库中进行同源性比较和鉴定。

3 结果

3.1 烟碱紫外吸收标准曲线

用0.05 mol/L盐酸溶液配制不同浓度(0、0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g/L)烟碱溶液, 以0.05 mol/L盐酸溶液做参比, 测定不同浓度溶液在259 nm处的吸光度值[13–14], 烟碱紫外吸收标准曲线如图1所示。由图1可知, 烟碱浓度在0.005～0.030 g/L范围内, 吸光值(Y)与烟碱浓度(X)呈正相关, 回归方程为Y = 34.457X + 0.020 4, R2= 0.999 4。

3.2 烟碱降解菌生长情况及降解率

YJ3培养液中加入菌悬液, 于37 ℃、180 rpm摇床中培养48 h后, 通过测定培养液中烟碱含量, 发现不同菌株烟碱降解能力有很大差异(表1), 从20.39%到52.17%。在10株菌中降解率超过40%的有5株，其中编号为5A-6-2的菌株降解率最高, 达到52.17%。

3.3 不同培养基保存对菌株降解烟碱性能的影响

以4A-1-1、4A-2、17A-1、17A-2为实验对象, 分别用LB培养基、YJ2培养基、YJ4培养基斜面划线培养一段时间, 制备菌悬液接种至YJ4培养液中, 于37 ℃、180 rpm摇床培养48 h, 检测培养液中烟碱的含量, 并计算烟碱降解率。结果如表2所示。

由表2可知, 烟碱为唯一碳源和氮源培养基保存的菌株比LB培养基保存的菌株降解烟碱能力强,其中YJ2浓度保存比LB培养基保存平均降解率高了14.61%; YJ4浓度下保存比LB培养基平均降解率高11.80%。

图1 烟碱紫外吸收标准曲线

表1 各个菌株降解3 g/L烟碱的降解率

表2 不同培养基保存的菌株烟碱降解率 /%

3.4 5A-6-2菌株降解烟碱性能

3.4.1 不同反应体系中5A-6-2降解效果

将等量5A-6-2菌悬液分别接种在YJ2液体培养基和LB2液体培养基中, 于37 ℃、180 rpm摇床中培养48 h, 以不接菌的空白培养基为对照, 检测培养液中烟碱的含量, 计算烟碱降解率。结果如表3所示。

由表3可知, YJ2培养基体系中烟碱降解率为45.25%, LB2培养基体系中烟碱降解率为68.65%,LB2培养基烟碱降解率较高, 表明在其他碳源等营养物质丰富的条件下, 菌株5A-6-2能够降解烟碱且降解效率较高。这一结果为菌株5A-6-2降解烟叶中烟碱提供理论支持。

3.4.2 利用YJ2和LB2培养基保存菌株降解效果对比

分别用YJ2和LB2培养基斜面保存菌种5A-6-2, 28 ℃恒温培养3～4 d, 制备菌悬液, 然后将菌悬液分别接种在LB2液体培养基中,于37 ℃、180 rpm摇床中培养48 h后, 检测培养液中烟碱含量。由表4可知, YJ2保存的菌株降解率为68.6%, LB2保存的菌株降解率为24.5%, YJ2保存菌株活性较高。

3.4.3 烟叶发酵实验

在三角瓶内研究5A-6-2菌株对烟叶中烟碱降解效果, 结果发现,以10%比例接入5A-6-2菌液, 28 ℃发酵7 d后, 烟叶烟碱含量下降了44.18%, 而对照组烟碱含量未下降, 这表明5A-6-2菌株对于降解烤后烟叶烟碱是有效的。

表3 不同反应时间体系中5A-6-2菌株的烟碱降解率 /%

表4 利用YJ2和LB2培养基保存的菌株不同时间降解效果对比 /%

3.5 烟碱降解菌16SrDNA序列的测定结果

PCR产物经连接、转化、阳性克隆的筛选和测序, 得到长度为1 500 bp的序列。为确定5A-6-2的分类学地位, 利用Blast在NCBI基因库中进行同源性检索[15–17], 显示5A-6-2与假单胞菌属(Pseudomon- as putida)的多种细菌具有较高的同源性(99%), 结合生理生化特性,确定该降解菌为假单胞菌属。

4 小结

本实验以筛选出的几株高效降解菌为研究对象, 研究保存菌株培养基的差异对菌株降解效率的影响, 结果表明以烟碱为唯一碳氮源的培养基保存菌株效果较好, 培养基中烟碱的浓度对降解率也有一定影响, 不同菌株对烟碱浓度的要求不同, 需要进一步探索研究。以5A-6-2为研究对象, 研究菌株对烟碱为唯一碳氮源的培养基(烟碱浓度2 g/L)和含有相同浓度烟碱的牛肉膏蛋白胨培养基中烟碱降解效果,结果表明, 菌株5A-6-2对牛肉膏蛋白胨培养基中的烟碱降解效率更高, 为菌株5A-6-2降解烟叶中烟碱提供理论支持。用菌株5A-6-2菌悬液降解调制后烟叶中烟碱, 发酵7d后, 烟叶中烟碱含量降解44.2%。

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(责任编校: 刘刚毅)

Nicotine degradation bacteria screening, save, and a preliminary study on the degradation of performance

Yin Quanyu, Zhang Yulan, Xu Xixi, Lu Shuang, Li Mengxia, Guo Fengqing, Liu Guoshun
(Tobacco College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to explore the different culture medium preservation methods, the degradation performance of nicotine-degrading bacteria under different culture conditions, with the nicotine regarded as the sole carbon source and nitrogen source, twenty-five nicotine-degrading bacteria are isolated from the tobacco-growing soil and rotten tobacco leaves of the modern tobacco agriculture science and education park of Xuchang Campus of Henan Agricultural University, and the nicotine concentration is 6 g/L, and several strains with high degradation efficiency are selected as the research object. The results show that the nicotine activity of the strain preserved with nicotine as the sole carbon source and nitrogen source (2～3 g / L nicotine) is higher. A nicotine-degrading bacterium 5A-6-2 is screened and still have strong ability of nicotine degradation when other carbon and nitrogen sources are present.5A-6-2 is inoculated into solid flue debris, and the nicotine content of tobacco leaves decrease by 44.2% after 7 d fermentation at 28 ℃. 16S rDNA sequence analysis shows that it is 99% homology to Pseudomonas putida.

nicotine degradation bacteria; screening; save; degradation characteristics

S 572

: A

1672–6146(2017)03–0028–05

10.3969/j.issn.1672–6146.2017.03.007

殷全玉, quanyuy@126.com; 刘国顺, liugsh@371.net。

: 2017–01–20

中国烟叶公司技改项目(3401302); 中国烟草总公司山东省公司科技重大专项和重点项目(201308)。