MicroRNA-143/145对大鼠子宫内膜异位症的治疗作用

梁宗文，赵渊，项军淼，张安琪，余丹扬，段萍

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 妇产科，浙江 温州 325027）

MicroRNA-143/145对大鼠子宫内膜异位症的治疗作用

梁宗文，赵渊，项军淼，张安琪，余丹扬，段萍

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 妇产科，浙江 温州 325027）

目的：研究microRNA（miRNA）-143/145对子宫内膜异位症（内异症）SD大鼠模型异位囊肿的治疗作用。方法：采用自体移植的方法建立大鼠内异症模型，并在病理组织学水平进行鉴定，选取18只建模成功的SD大鼠随机分为空白组（n=6）、阴性对照组（n=6）、miR-143/145类似物组（n=6），分别予以相应的处理，最后剖腹探查，用游标卡尺测量SD大鼠内异症模型异位囊肿的大小，比较3组间异位囊肿体积的差异，并比较3组间组织病理学的变化。结果：SD大鼠内异症建模成功率为84%；异位囊肿体积差异：治疗后空白组囊肿体积大小为（16.38±4.19）mm3，阴性对照组为（21.14±0.51）mm3，miR-143/145类似物组为（5.91±1.91）mm3，空白组与阴性对照组比差异无统计学意义（P＞0.05），而miR-143/145类似物组与阴性对照组比囊肿体积明显减小，差异有统计学意义（P＜0.01）。病理组织学变化：空白组与阴性对照组异位病灶病理组织学形态相似，而阴性对照组与miR-143/145类似物组相比，腺体数量减少，腺体萎缩，间质细胞排列杂乱。结论：miR-143/145可以使内异症的异位病灶萎缩而达到治疗效果。

子宫内膜异位症；miR-143/145；大鼠；治疗

子宫内膜异位症（简称内异症），是子宫内膜组织生长在子宫腔以外的部位，以卵巢最多见。临床症状以月经不调、慢性盆腔痛和不孕为主，大大降低了患者的生活质量，目前治疗手段以手术为主，但术后复发率高[1-2]，且无针对内异症的特效药。微小RNA（microRNA，miRNA）是包含18～25个核苷酸的非编码RNA，通过结合于下游靶mRNA的3’非编码区而调控基因的表达，使其表达下调或沉默[3-4]。miR-143和miR-145在染色体上基因位点非常接近，组成一个基因簇。研究表明miR-143/145在内异症中异常表达[5-6]。本课题组前期研究结果表明miR-143/145在内异症子宫内膜组织中表达高于非内异症[7]。ADAMMEK等[8]报道miR-145抑制内异症细胞的增殖侵袭和干细胞表型，表明miR-145可以在一定程度上影响内异症的发生发展，但是目前还缺乏miR-143/145基因簇影响内异症发生发展的在体实验，所以本研究通过建立SD大鼠内异症模型，将miR-143/ 145对内异症的作用进行在体实验，探究miR-143/ 145是否可以作为治疗内异症的一种新型药物。

1 材料和方法

1.1 实验动物 性成熟雌性SD大鼠25只，6～8周龄，体质量180～200 g，购自温州医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（浙）2015-0001，给予标准光照（12 h光照，12 h黑夜），室内温度18～22 ℃，湿度40%～50%，标准饲料和水。实验结束后，所有大鼠经戊巴比妥钠麻醉后颈椎脱臼安乐死。

1.2 实验器械及主要试剂 普通手术器械及眼科剪；miR-143、miR-145类似物（miR-143/145 mimic）及其阴性对照药品（mimic NC）（广州锐博生物科技有限公司）；动物体内转染试剂（英格恩生物科技有限公司）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 SD大鼠内异症模型的建立[9]：造模前1 d每只大鼠肌注雌二醇0.1 mg/kg，使动物统一处于动情期。10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，将大鼠固定后腹部备皮，常规消毒铺洞巾，尿道口上方约1 cm处正中开腹，行纵切口约3 cm，钝镊找到并分离出大鼠右侧子宫，在近端离子宫角约1 cm处结扎子宫，远端离卵巢约2 cm处结扎子宫，迅速剪下子宫，置入磷酸盐缓冲液中，剔净系膜，纵向切开子宫，尽可能剥除浆膜层，将内膜组织剪成5 mm×5 mm大小的片段，部分用4%多聚甲醛进行固定，做病理切片以证实是子宫内膜组织，部分以内膜面贴向腹壁，用4/0的缝合线分别在4个角各缝1针固定，腹腔注射氨苄青霉素16万IU/kg，然后逐层缝合腹壁和皮肤（见图1）。术后第1天腹腔注射氨苄青霉素16万IU/kg，每天1次，连续5 d。术后第2天肌注雌激素0.1 mg/kg，4天1次，共3次。常规饲养。

1.3.2 异位囊肿体积的测量：建模4周后，10%水合氯醛腹腔注射，将大鼠麻醉后再次开腹，建模成功的内异症大鼠中，移植的子宫内膜内充满清亮液体，形成异位囊肿，肉眼大体观察异位囊肿的形态及大小，用游标卡尺测量异位病灶的长、宽和高，计算异位囊肿体积=0.5×长×宽×高。

1.3.3 标本取材及HE染色：取左侧未进行手术的子宫及异位病灶，4%多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色进行组织病理学观察。镜下出现子宫内膜、间质、腺体或腺体样结构和出血中的2种便可以确认造模成功。

1.4 药物制备及动物给药

1.4.1 药物制备：将核酸miR-143、miR-145类似物及阴性对照mimic NC用除菌双蒸水稀释至1 μg/μL，按说明书将核酸及体内转染试剂按一定比例进行混合：核酸（μg）/转染试剂（μL）=2∶1，混合后常温下静置15 min。每个异位囊肿注射30 μL的转染混合物（15 μL核酸+7.5 μL体内转染试剂+7.5 μL灭菌双蒸水）。

1.4.2 动物给药：第1次术后4周，将SD大鼠随机分为3组：空白组、阴性对照组、miR-143/145类似物组，每组分别注射30 μL 0.9%氯化钠溶液、30 μL mimic NC混合物、30 μL miR-143/145 mimic混合物，基于英格恩体内转染试剂说明书，每隔3 d给药1次，共4次，最后1次给药48 h后处死实验动物，观察记录各组异位病灶形态及大小变化，并取异位病灶组织进行石蜡包埋，病理生理学水平观察各组间异位病灶的改变。

图1 SD大鼠内异症模型的建立

1.5 统计学处理方法 所有数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。结果以±s表示，计量资料用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠内异症模型的建立 用25只SD大鼠建立内异症模型，其中1只因麻醉过度死亡，1只因术后腹腔感染引起肠粘连及肠梗阻而死亡，建模4周后剖腹探查，有2只大鼠建模未成功，建模成功率为84%。可见异位病灶呈囊性增大，圆形或椭圆形，内含淡黄色或淡血性清亮囊液，异位囊肿表面及其周围有血管形成，部分囊肿周围也有少许结缔组织包被（见图1e）。轻轻取下完整的异位子宫内膜病灶，及其对应大鼠的在位子宫，与大鼠正常子宫作对比，组织病理学观察可见，异位囊肿含有子宫内膜腺体及其间质细胞，光镜下观察固有层及固有层腺体样结构及其间质细胞与在位内膜和正常大鼠子宫内膜相似，但异位组织腺体数量减少，有不同程度的纤维化，且异位内膜上皮细胞呈低柱状或锯齿状生长，间质层变薄，结缔组织较多，在位内膜及大鼠正常内膜内可见丰富的腺体结构，腺上皮细胞呈柱状或高柱状生长（见图2）。

2.2 3组异位病灶的体积比较 选取建模良好的18只内异症大鼠，随机分成空白组、阴性对照组和miR-143/145类似物组，3组的异位囊肿体积分别为：（19.88±1.15）mm3、 （20.66±0.91）mm3和（20.45± 0.52）mm3，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药后空白组异位囊肿体积为（16.38±4.19）mm3，阴性对照组为（21.14±0.51）mm3，miR-143/145类似物组为（5.91±1.91）mm3，空白组和阴性对照组的异位囊肿体积大小差异无统计学意义（P＞0.05），但miR-143/145类似物组与阴性对照组比，异位囊肿体积明显减小，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

2.3 3组异位病灶的病理组织学比较 分别将空白组、阴性对照组及miR-143/145类似物组异位病灶固定切片后HE染色，光镜下观察，移植的子宫内膜组织成活，形成的囊壁由内向外分别为腺上皮细胞层、间质细胞层及少量纤维结缔组织，囊内为少量白细胞及黏液。阴性对照组异位内膜腺上皮细胞呈低柱状或立方形，排列在囊泡内腔面，细胞间连接较紧密，细胞核大，呈椭圆形，胞浆丰富，内膜间质丰富。空白组与阴性对照组病理组织学结果相似，而miR-143/145类似物组子宫内膜腺体萎缩，腺上皮层变薄，细胞呈立方或扁平状，形态欠规则，间质细胞排列紊乱，胞浆嗜碱性细胞增加。见图4。

图2 建模成功后子宫内膜的病理组织学变化（HE，×200）

图3 给药后3组内异症病灶的体积

3 讨论

内异症发生发展的机制尚不明确，但SAMPSON的“经血逆流”是目前公认的主要机制[10-12]。当前内异症的治疗以手术为主，但术后5年复发率仍有40%左右[13]，严重影响了广大女性患者的生活质量及治疗积极性，目前内异症缺乏特别有效的治疗方式及手段。

本课题组前期研究结果表明miR-143及miR-145在内异症异位病灶及在位内膜的表达均高于非内异症的正常子宫内膜[7]，亦有研究报道miR-143/145在内异症中的高表达，一定程度上是抑制内异症的发生发展，但目前尚缺乏miR-143/145的活体实验。

图4 给药后各组异位病灶的病理组织学变化（HE，×200）

本研究采用自体移植的方法建立内异症大鼠模型，将建模成功的大鼠分为空白组、阴性对照组和miR-143/145类似物组，并进行相应的处理，实验结果表明，与空白组和阴性对照组相比miR-143/145类似物组子宫内异症异位病灶明显缩小，在病理组织学水平，与空白组和阴性对照组相比miR-143/145类似物组子宫内膜腺体数目减少，腺体萎缩，组织结构排列紊乱，说明miR-143/145可以使异位子宫内膜萎缩，腺体分泌减少，从而使异位囊肿逐渐萎缩，进而达到治疗内异症的效果。

综上所述，miR-143/145在内异症中表达失调，且在SD大鼠内异症模型中，miR-143/145有一定的治疗效果，所以miR-143/145有可能成为内异症治疗的新型药物。但是在内异症中特异表达的miRNA数量众多[14]，其调控机制复杂[15]，因此，尚需进一步研究。

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（本文编辑：赵翠翠）

Effect of microRNA-143/145 on endometriosis in SD-rat models

LIANG Zongwen, ZHAO Yuan, XIANG Junmiao, ZHANG Anqi, YU Danyang, DUAN Ping. Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the therapeutic effect of miR-143/145 on endometriosis cysts in SD rat models.Methods:The model of endometriosis in SD rats was established by autologous transplantation, and was identified at the histopathological level. Eighteen SD rats were randomly divided into blank control group (n=6), negative control group (n=6) and miR-143/145 mimic group (n=6), were given the corresponding treatment, respectively. Finally laparotomy, and the size of ectopic cysts were measured by vernier caliper, and the volume of ectopic cysts were compared among the three groups. The histopathological changes of the three groups were also compared.Results:The successful rate of modeling of endometriosis in SD rats was 84%. After treatment, the difference in the volume of ectopic cysts in each group： the volume of ectopic cysts in control group was (16.38±4.19) mm3, negative control group was (21.14±0.51) mm3, miR-143/145 mimic group was (5.91±1.91) mm3. There was no signifi cant difference between the blank control group and the negative control group (P＞0.05), however, the volume of ectopic cysts in the miR-143/145 mimic group was signifi cantly reduced compared with negative control group (P＜0.01). The histopathological changes： the histopathological morphology of ectopic cyst in blank control group and negative control group was similar, but in miR-143/145 mimic group the number of glands was decreased, the glandular atrophy, and the arrangement of stromal cell were messy compared with the mimic NC group.Conclusion:MiR-143/145 can atrophy ectopic cysts of endometriosis and achieve therapeutic effect.

endometriosis; miR-143/145; rats; treatment

R711.71

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.06.002

2016-11-08

国家自然科学基金资助项目（8140060904）；浙江省卫生厅平台重点资助项目（2013RCA035）；温州市科技局科研基金资助项目（Y20100175）；浙江省科技厅公益项目（2014C37003）。

梁宗文（1990-），女，甘肃白银人，硕士生。

段萍，主任医师，Email：dppddpp@126.com。