响应面法优选黄精发酵功能饮料的工艺和配方

李安，袁小卓，孙亚茹，田昌义，吴德智*

（贵州理工学院创新创业中心，贵州贵阳550001）

响应面法优选黄精发酵功能饮料的工艺和配方

李安，袁小卓，孙亚茹，田昌义，吴德智*

（贵州理工学院创新创业中心，贵州贵阳550001）

以滇黄精为主要原料，研制具有营养价值以及保健功能的黄精发酵功能饮料。以感官评分为评价指标，通过单因素试验和Box-Behnken响应面法分别对发酵工艺及饮料的配方及进行优化。结果表明，黄精发酵功能饮料的最佳的发酵制备工艺为发酵温度42℃，发酵时间17 h，液料比14∶1（mL∶g），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bugaicus）∶嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）配比1∶1，接种量5.0%，黄精发酵浆感官评分为93.27分；黄精发酵功能饮料配方为黄精发酵浆15%、柠檬酸0.7%、白砂糖10%、复合稳定剂0.6%。在此最佳条件下，黄精发酵功能饮料的感官评分为90.21分，产品质地均匀、香气协调、口感细腻。

黄精；发酵饮料；工艺；配方；Box-Behnken试验

黄精（Rhizoma polygonatum）为百合科黄精属植物滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎。中医学认为黄精味甘性平，具有补中益气、健脾润肺，益肾强骨的功效[1]，其主要含有黄精皂苷、烟酸、糖类、醌类、氨基酸及微量元素等多种成分，具有延缓衰老、增强免疫功能、调血脂、降血糖、抗肿瘤等多种药理作用[2]。国内外对黄精在营养保健、中老年疾病预防等方面的增值化产品已成为热点，市场上已出现胶囊、颗粒、糖浆、茶、面膜等产品，但关于黄精果汁发酵饮料的研究还较为缺乏[3-4]。发酵饮料是通过菌种发酵后调配的酒精含量在1%vol以下的饮料[5]，其中含有大量的益生菌，不仅能改善食品的风味、品质和营养，延长保质期，还具有调节肠道菌群平衡、抗肿瘤、降低胆固醇、防治便秘、延缓衰老等重要的生理作用[6-7]。随着人们对饮食结构及饮食习惯向营养保健方面转化，发酵功能性饮料产品将不断涌现，市场将蓬勃发展[8]。

本研究以滇黄精为主要原料，采用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bugaicus）混合发酵，研制黄精发酵功能饮料，通过单因素及Box-Behnken响应曲面试验分别对黄精发酵功能饮料的发酵工艺及配方进行优化，为发酵功能饮料的研究与开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滇黄精：云南绿生药业有限公司；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bugaicus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：南京益生源生物科技有限公司；福林酚试剂：南京奥多福尼生物科技有限公司；琼脂、羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、黄原胶：河南中偌生物科技有限公司；无水乙醇：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TDZS-WS型离心机：济南福的机械有限公司；280A型手提式高压灭菌锅：上海上天精密仪器有限公司；LHS-250SC恒温培养箱：上海析域仪器设备有限公司；FA1004B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；Scientz-150高压均质机：宁波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2型高速组织粉碎机：金坛市天竟实验仪器厂；WZ113手持糖度计：北京万成北增精密仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵剂的制备

将1∶1的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合，于37℃、10%的脱脂乳100 mL中活化2次，加入50 mL黄精汁（黄精粉末与蒸馏水料液比为1∶50（g∶mL））和10%的脱脂乳50mL，37℃培养至凝乳2次，再在90 mL黄精汁和10%的脱脂乳10 mL混合液37℃下培养至凝乳，无菌水制备菌悬液，保持乳酸菌数在107～108CFU/mL即为发酵剂。

1.3.2 黄精发酵功能饮料的制备

滇黄精洗净后用90℃热水烫2 min，迅速冷却至室温。组织捣碎机进行破碎，按实验要求将黄精和水按照一定的料液比打浆，混合料液在45 MPa下均质15 min，得黄精果浆。以感官评分为评价指标，按1∶1接入保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，按实验要求的接种量、发酵时间、料液比进行发酵，发酵结束后于4℃条件下后熟24h，得黄精发酵浆。再将黄精发酵浆、柠檬酸、白砂糖按实验要求的比例进行混合后，根据预实验结果加入0.6%复合稳定剂（琼脂∶CMC-Na∶黄原胶为1∶3∶2）进行调配，在60℃、25 MPa下均质1 h。均质后110℃灭菌30 min，即得黄精发酵功能饮料[9]。

1.3.3 黄精发酵浆的发酵工艺优化单因素试验

本试验针对发酵时间（5 h、10 h、15 h、20 h、25 h）、液料比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL∶g）、接种量（2%、3%、4%、5%、6%）3个因素，保持其中2个变量固定不变，对另1个变量进行单因素试验，以黄精发酵浆的感官评分为评价指标，考察发酵时间、液料比及接种量对黄精发酵浆的感官品质的影响。

1.3.4 Box-Behnken响应曲面法优化黄精发酵浆发酵工艺

在单因素试验的基础上，选取发酵时间（A）、液料比（B）、接种量（C）3个因素，采用Design-Expert 8.0.6设计的Box-Behnken试验，以黄精发酵浆感官评分为评价指标，优化提取工艺参数，Box-Behnken试验因素与水平如表1所示。1.3.5黄精发酵功能饮料的配方优化单因素试验

表1 发酵工艺优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

本实验针对黄精发酵浆（5%、10%、15%、20%、25%）、柠檬酸（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、白砂糖（3%、6%、9%、12%、15%）添加量3个因素，保持其中2个变量固定不变，对另1个变量进行单因素试验，以黄精发酵功能饮料的感官评分为评价指标，考察黄精发酵浆、柠檬酸及白砂糖添加量对黄精发酵功能饮料的感官品质的影响。

1.3.6 响应曲面优化黄精发酵功能饮料配方

以黄精发酵功能饮料的感官评分为评价指标，在配方优化的单因素试验基础上，选取黄精发酵浆（A）、柠檬酸（B）、白砂糖（C）3个对发酵饮料感官评分影响较大的因素。采用Design-Expert 8.0.6软件设计的Box-Behnken试验，试验因素与水平见表2。

表2 饮料配方优化Box-Behnken试验因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments for beverage formula optimization

1.3.7 理化指标的测定方法

乳酸菌总数测定按照国标GB 4789.35—2010《食品微生物学检验乳酸菌检验》中的乳酸菌平板计数法；可溶性固形物测定采用折光法；pH值测定采用酸度计；总糖含量测定采用手持测糖仪；总黄酮含量测定采用紫外分光光度法。

采用10名符合感官评定的人员（无特殊口味偏好）进行感官评定，采用百分制分别对黄精发酵浆及黄精发酵饮料进行感官评分[10-11]，满分均为100分，具体评分标准分别见表3、表4。

表3 黄精发酵浆的感官评价标准Table 3 Sensory evaluation standards of fermentedRhizoma polygonatumpulp

表4 黄精发酵功能饮料的感官评价标准Table 4 Sensory evaluation standards of fermentedRhizoma polygonatumfunctional beverage

1.3.9 统计分析

所有数据测定3次平行、取平均值，结果以平均值±标准偏差表示，采用Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 黄精发酵浆的发酵工艺优化单因素试验

发酵时间、液料比及接种量对黄精发酵浆感官评分的影响，结果见图1。

由图1a可知，随着发酵时间的延长，黄精发酵浆的感官评分呈现先上升后下降的趋势。当发酵时间为15 h时，感官评分最高（89.27分）。发酵时间降低或延长，都会因酸甜不协调而影响口感，且发酵时间的增加，微生物所需的营养物质减少以及次生代谢产物阻碍菌体生长所致。因此选定10～20 h为响应面设计的水平。

由图1b可知，随着液料比的增加，黄精发酵浆的感官评分呈现先上升再下降的趋势。当液料比为15∶1（mL∶g）时，感官评分最高（90.17分）。当液料比＜15∶1（mL∶g），饮料浓稠度过大，不适宜发酵且口感不佳；当液料比＞15∶1（mL∶g），黄精香气不足，溶液清稀且不稳定，营养含量少乳酸菌生长发酵缓慢。因此选定液料比10∶1～20∶1（mL∶g）为响应面设计的水平范围。

2.在实验教学方法上，应运用新技术、新理念、新设备等予以建立、提升、完善和创新。应重视以下几种实验教学方法的实施与管理。

由图1c可知，随着接种量的增加，感官评分呈现先上升后下降的趋势。当接种量为4%时，感官评分最高（89.27分）。主要是因为当接种量不足时发酵剂不足以使黄精完全发酵，发酵浆组织不均匀，分层，有物质析出；当接种量过大时前期的反应消耗过多能量，不足以使反应持续，依据影响发酵浆品质。因此选定4%～6%为响应面设计的水平。

图1 发酵时间（a）、液料比（b）和接种量（c）对黄精发酵浆感官品质的影响Fig.1 Effects of fermentation time(a),liquid-solid ratio(b)and inoculum(c)on sensory quality of fermentedRhizoma polygonatumpulp

2.2 Box-Behnken响应曲面设计优化黄精发酵浆发酵工艺

根据单因素试验结果，以黄精发酵浆感官评分（Y）为响应值，选取发酵时间（A）、液料比（B）、接种量（C）为影响因素，进行3因素3水平响应面试验分析，响应面试验设计及结果见表5，回归模型方差分析结果见表6。

采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken试验，对各因素进行拟合，得到多元回归方程为：

由表6可知，该模型方程有显著性影响（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.660 3＞0.05），说明在本试验条件下，该回归模型所考察的因素足以反映试验中各提取工艺参数对黄精发酵浆感官评分的影响。判定系数R2=0.981 8， R2adj=0.958 4，说明回归模型与试验值拟合均较好，可用于黄精发酵浆的理论推测和分析，各因素影响大小依次为发酵时间＞接种量＞液料比。由F检验可知，一次项中发酵时间与接种量对黄精发酵浆的感官评分具有极显著影响（P＜0.01），交互项中发酵时间与液料比、液料比与接种量之间的交互作用对黄精发酵浆的感官评分具有显著影响（P＜0.05），在二次项中发酵时间对黄精发酵浆的感官评分具有极显著影响（P＜0.01）；液料比对黄精发酵浆的感官评分具有显著影响（P＜0.05）；其他因素影响不显著（P＞0.05）。

由Design-Expert8.0.6软件处理得到各因素交互作用的响应面及等高线见图2。由图2可知，发酵时间与液料比、液料比与接种量曲面相对来说比较陡一些，说明交互作用对发酵功能饮料的感官评分具有显著影响；而发酵时间与接种量曲面相对较平缓，说明交互作用对发酵功能饮料的感官评分影响较小。

表5 发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization

表6 发酵工艺优化回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model for fermentation technology optimization

图2 发酵时间、液料比和接种量交互作用对黄精发酵浆感官品质影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,liquid-solid ratio and inoculum on sensory quality of fermentedRhizoma polygonatumpulp

由Design-Expert 8.0.6软件得出黄精发酵浆的最佳工艺参数是发酵时间16.85 h，液料比13.63∶1（mL∶g），接种量4.97%，黄精发酵浆的感官评分的预测值为93分。为便于生产实际需求，将黄精发酵浆的最佳工艺参数修改为发酵时间17 h，液料比14∶1（mL∶g），接种量5.0%，进一步验证试验，得出的黄精发酵浆的感官评分为93.27分。该值与预测值比较近，证明了该方法的可行性。

2.3 黄精发酵功能饮料配方优化单因素试验

由图3a可知，随着黄精发酵浆添加量的增加，发酵功能饮料的感官评分出现先升高后降低的趋势。当精发酵浆添加量为15%时，感官评分最高（89.77分）。继续增加黄精发酵浆，由于黄精本身的涩味，添加量过大饮料苦涩过大而影响口感。因此选择黄精发酵浆添加量为10%～20%。

由图3b可知，随着柠檬酸添加量的增加，黄精发酵功能饮料的感官评分先升高后下降的趋势。当柠檬酸添加量为1%时，感官评分最高（89.56分）。柠檬酸添加量过多或不足，发酵饮料的口感出现酸甜不一的现象[12]。因此选择柠檬酸添加量为0.5%～1.5%。

由图3c可知，随着白砂糖添加量的增加，黄精发酵功能饮料的感官评分呈现先升高后下降再稳定在一定水平的趋势。当白砂糖添加量为9%时，感官评分维持最高（89.31分）。要是由于白砂糖量的增加会使饮料的渗透压增大，从而抑制微生物发酵，使得饮料酸度呈下降，pH值升高，以及过甜而影响口感[13]。因此选择白砂糖添加量为6%～12%。

图3 不同黄精发酵浆（a）、柠檬酸（b）及白砂糖（c）添加量对黄精发酵功能饮料感官评分的影响Fig.3 Effects of different fermentedRhizoma polygonatumpulp(a),citric acid(b)and sugar(c)addition on sensory score of fermentedRhizoma polygonatumfunctional beverage

2.4 响应曲面法优化发酵功能饮料配方

以黄精发酵功能饮料的感官评分（Y）为响应值，在配方优化的单因素试验基础上，选取黄精发酵浆（A）、柠檬酸（B）、白砂糖（C）添加量为影响因素。Box-Behnken响应面试验设计及结果见表7，回归模型方差分析见表8。

表7 饮料配方优化Box-Behnken试验设计及结果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments for beverage formula optimization

采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken试验，对各因素进行拟合，得到多元回归方程为：

由表8可知，该实验模型方程显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.073 1＞0.05），在本试验条件下，此回归模型所考察的因素足以反映各成分对发酵功能饮料口感的影响，判定系数R2=0.982 3，R2adj=0.959 5，说明回归模型与试验值拟合较好，可用于发酵功能饮料感官评分的理论推测和分析，各因素影响大小依次为白砂糖添加量＞黄精发酵浆添加量＞柠檬酸添加量。由F检验可知，一次项中白砂糖添加量与黄精发酵浆添加量对发酵功能饮料的感官评分具有极显著影响（P＜0.01），交互项中黄精发酵浆与柠檬酸添加量、黄精发酵浆与白砂糖添加量之间的交互作用对发酵功能饮料的感官评分具有显著影响（P＜0.05），在二次项中白砂糖、黄精发酵浆、柠檬酸添加量对发酵功能饮料的感官评分具有极显著影响（P＜0.01）；其他因素之间交互作用不显著（P＞0.05）。

表8 饮料配方优化回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model for beverage formula optimization

由Design-Expert 8.0.6软件处理得到各因素交互作用的响应面及等高线见图4。由图4可知，黄精发酵浆与柠檬酸添加量、黄精发酵浆与白砂糖添加量曲面相对来说比较陡一些，说明交互作用对发酵功能饮料的感官评分具有显著影响；而柠檬酸与白砂糖曲面相对较平缓，说明交互作用对发酵功能饮料的感官评分影响较小。

图4 黄精发酵浆、柠檬酸及白砂糖添加量交互作用对黄精发酵功能饮料感官评分影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentedRhizoma polygonatumpulp,citric acid and sugar addition on sensory quality of fermentedRhizoma polygonatumfunctional beverage

由Design-Expert8.0.6软件得出黄精发酵功能饮料最优配方为：黄精发酵浆15.33%、白砂糖10.22%、柠檬酸0.74%，复合稳定剂为0.6%，感官评分预测值为89.52分。为便于生产实际操作，将配方修改为黄精发酵浆15%、白砂糖10%、柠檬酸0.7%，复合稳定剂为0.6%，选取该组合做进一步的验证试验，得出黄精发酵功能饮料的感官评分为90.21分。为与预测值相近，证明了该方法的可行性。

2.5 黄精发酵功能饮料质量评价

2.5.1 感官指标

色泽：呈淡黄色，色泽均一稳定，有较好的光泽度，口感纯正，酸甜适中，无异味，细腻，流动性好；滋味：有黄精气味和发酵风味。

2.5.2 理化指标

滴定酸度：92.22°T；总糖：8.21 g/100 g；活菌数对数值：9.21 lg（CFU/g）；pH值为3.9；可溶性固形物6.2%（20℃）；总黄酮含量：0.278 g/L。黄精发酵功能饮料的微生物指标符合国标GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》[14]。

2.5.3 微生物指标

由表9可知，黄精发酵功能饮料的微生物指标符合国标GB 16321—2003《乳酸菌饮料卫生标准》[15]。

表9 黄精发酵功能饮料的微生物指标Table 9 Microorganism indexes of fermentedRhizoma polygonatum functional beverage

3 结论

以滇黄精为主要原料，利用菌种发酵，研制具有营养价值以及保健功能的黄精发酵功能饮料。结果黄精发酵功能饮料的最佳的发酵制备工艺为发酵温度42℃，发酵时间17 h，液料比14∶1（mL∶g），接种量5.0%，黄精发酵浆感官评分为93.27分，发酵饮料配方为黄精发酵浆15%、柠檬酸0.7%、白砂糖10%、复合稳定剂为0.6%，得出的黄精发酵功能饮料的感官评分为90.21分。在此条件下制备的饮料工艺稳定可行，产品质地均匀、香气协调、口感细腻，为发酵功能饮料的研究提供一定的参考。

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[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 16321—2003乳酸菌饮料卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2003.

Optimization of technology and formula of fermentedPolygonatum kingianumfunctional beverage by response surface method

LI An,YUAN Xiaozhuo,SUN Yaru,TIAN Changyi,WU Dezhi*
(Innovation and Entrepreneurship Center,Guizhou Institute of Technology,Guiyang 550001,China)

UsingPolygonatum kingianumas main raw material,a fermented beverage with nutritional value and healthcare function was developed. Using sensory evaluation score as evaluation index,the fermentation technology and formula was optimized by single factor experiment and Box-Behnken response surface methodology.Results showed that the optimized fermentation parameters were fermentation temperature 42℃,time 17 h, liquid-solid ratio 14∶1(ml∶g),Lactobacillus bugaicusandStreptococcus thermophilusratio 1∶1,inoculum 5.0%.The sensory evaluation score of the beverage was 93.27.The optimized formula was fermentedP.kingianumpulp 15%,citric acid 0.7%,sugar 10%and compound stabilizer 0.6%.Under the optimal conditions,the sensory score of the functional beverage was 90.21,the product texture was uniform,the aroma was coordinated and the taste was delicate.

Rhizoma polygonatum;fermented beverage;technology;formula;Box-Behnken experiments

TS252.54

0254-5071（2017）06-0187-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.039

2017-05-27

国家大学生创新创业项目（201614440047）；贵阳市科技局“创客空间”项目（筑科合同[20151001]2-7号）

李安（1989-），女，讲师，硕士，研究方向为天然产物提取与保健食品开发。

*通讯作者：吴德智（1983-），男，副教授，博士，研究方向为食品与药品研究与开发。